Первичный посев и пересев
Добавил пользователь Евгений Кузнецов Обновлено: 19.09.2024
Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ
а) Пересев из колоний на скошенный агар
Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды. Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.
б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон
Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду. При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенку сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.
Методические указания к практической работе
Выделение отдельных видов бактерий из исследуемого материала является одним из этапов любого бактериологического исследования.
Обычно для выделения чистой культуры затрачивают 3-4 дня, но в некоторых случаях это время удлиняется, например, для выделения туберкулезных бактерий нужно 4-6 недель.
Первый этап
Посев исследуемого материала. Прокаленной остуженной петлей берут материал из пробирки (задача №. ) и распределяют по поверхности среды петлей, нанося параллельные штрихи на расстоянии 0,4-0,6 см один от другого, от одного края чашки к другому, держа петлю плашмя, чтобы не поцарапать питательную среду. Чашки подписывают (название материала, фамилия, дата посева) со стороны дна и помещают в термостат дном кверху, чтобы капельки конденсата, образующиеся на крышке, не стекали на среду и не размывали посевы.
Второй этап
Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Так как материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии, очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их. Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет; полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).
Посев – внесение инокулята (части исследуемого материала) в стерильную питательную среду, пересев – перенос части выращенной на питательной среде культуры микроорганизма на другую, свежую стерильную среду.
Посев (пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении правил стерильности, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду исследуемыми культурами микроорганизмов.
Пересев микроорганизмов, выращенных на твёрдой среде в пробирках, в другие пробирки с плотной средой. Посевы петлей на скошенную агаризованную среду производят: зигзагообразным штрихом, начиная со дна косяка где есть конденсационная вода, скользя петлёй по поверхности плотной среды от одного края пробирки к другому; прямой чертой, для чего проводят петлёй прямую линию снизу вверх посередине поверхности питательной среды; сплошным посевом, распределяя материал круговыми движениями по всей поверхности среды. При посеве и пересеве необходимо соблюдать следующие приёмы:
В левую руку берут две пробирки – одну со стерильной средой, другую – с культурой и держат в наклонном положении. В правой руке большим и указательным пальцем держат бактериальную петлю и стерилизуют в пламени горелки.
2. Вынимают ватные пробки из обеих пробирок, прижимают их к ладони мизинцем и безымянным пальцами правой руки и обжигают края пробирок. Следят за тем, чтобы пробки не касались посторонних предметов.
3. Петлю вводят в пробирку с пересеваемой микробной культурой. Осторожно, не касаясь стенок, отбирают каплю жидкой культуры. Если производят пересев со скошенной питательной среды, то для охлаждения петли вначале следует прикоснуться к поверхности ПС или внутренней стенки пробирки, где нет культуры, после чего берут небольшое количество микробной массы с плотной среды на кольцо петли.
4. Вводят петлю с материалом в пробирку со стерильной жидкой средой, стараясь не задевать стенок пробирки. При посеве на скошенные питательные среды петлю с клетками микроорганизмов опускают почти до дна, где скапливается небольшое количество конденсационной воды. Слегка касаясь кольцом петли поверхности плотной среды, проводят от дна вверх штрих.
Петлю вынимают, обжигают края пробирок и внутренние концы пробок, после чего пробирки закрывают.
Петлю вновь прокаливают в пламени горелки и ставят в штатив или стакан вверх кольцом петли.
На пробирке делают надпись: название культуры и дату посева.
Пересев культур микроорганизмов в жидкую среду. Пересев в жидкую среду можно производить петлей или пипеткой. Обе пробирки держат в слегка наклонном положении, чтобы не замочить ватные пробки. Петлей или пипеткой отбирают материал из пробирки с выросшей культурой и переносят в пробирку со стерильной средой. При внесении клеток, взятых петлей из плотной среды, материал тщательно растирают по стенке пробирки у верхнего края жидкой стерильной среды, все время, смывая его средой. Засеянные пробирки закрывают, подписывают, датируют и ставят на инкубирование.
Пересев на плотные среды в чашки Петри. Пересев в чашки Петри проводится глубинным и поверхностным способами.
Поверхностный способ посева: плотную стерильную питательную среду расплавляют на кипящей водяной бане и, соблюдая правила стерильности, разливают ровным слоем толщиной 3-5 мм в стерильные чашки Петри. Оставляют до полного застывания среды. На поверхность среды вносят инокулят и стеклянным шпателем равномерно распределяют его по поверхности (посев газоном) или петлей в виде параллельных или зигзагообразных штрихов.
Глубинный способ посева: на дно стерильной чашки Петри вносят петлей или пипеткой определённый объём посевного материала. Обжигают края пробирки или колбы в пламени горелки и заливают расплавленной охлаждённой агаризованной питательной средой, соблюдая правила асептики. Распределяют равномерно посевной материал в питательной среде, для чего круговыми движениями перемещают чашку Петри по поверхности стола. Оставляют до полного застывания.
Посев уколом на плотные среды. Такой посев производят в пробирки с нескошенной агаризованной питательной средой. При посеве пробирки держат вверх дном.
Все посевы, выполненные описанными способами, подписывают, помещают в термостат перевёрнутыми вверх дном (для посевов в чашки Петри) для выращивания микроорганизмов при температуре, благоприятной для их роста.
4.6. Процедуры пересева культур в стерильных условиях
Лучшим местом для манипуляций с культурами и стерильными материалами является ламинарный бокс с вытяжкой, размещенный в не- большой закрытой комнате. Если нет такого бокса, для пересевов можно использовать небольшое по размерам изолированное помещение. Эту ком- нату необходимо оборудовать ультрафиолетовой лампой и бунзеновской горелкой (или спиртовкой). Если нет возможности использовать комнату, то можно работать в обычной лаборатории, соблюдая меры стерильности. Независимо от оснащенности стерильного помещения, источником загряз нения может быть воздух, рабочая поверхность, внутренние поверхности сосудов, контейнеров и т.д. Поэтому все манипуляции следует проводить так, чтобы уменьшить риск загрязнения. В Соединенных Штатах перед на- чалом работы в воздухе распыляют лизол (Kawachi, Noel, 2005). Этот спрей нейтрализует коллоидные частицы в воздухе, такие как пыль и спо- ры, позволяя им осесть на поверхность стола или пола, после чего все по- верхности протирают 70% этанолом.
Рабочее место и материалы следует располагать таким образом, что- бы уменьшить циркуляцию воздуха (рис. 7). Исследователь должен совер- шать как можно меньше движений, все его движения должны быть мед- ленными. Следует избегать перекрещивания рук и хаотичных движений с пипетками в воздухе. Наличие ламинарного бокс с вытяжкой позволяет быть уверенным в том, что воздушная пыль не проникнет на рабочее ме- сто, однако следует постоянно проверять состояние фильтров бокса. Если фильтры загрязняются, то бокс становится потенциальным источником за- грязнения (Kawachi, Noel, 2005).
Рис. 7. Ламинарный бокс с горелкой Бунзена и лабораторными мате- риалами, организованный для работы праворукого человека (Kawachi, Noel, 2005). Порядок расположения материалов обозначен буквами от (a) до (f). Пробирки расположены в определенном порядке для облегчения ра- боты и избежания ошибок при пересеве
Перед работой необходимо проверить состояние стерильных мате- риалов, их не следует использовать, если нет уверенности в их чистоте. Обработать все рабочее место 70% этанолом. Перед работой следует на- деть латексные перчатки, которые нужно часто менять, или протирать ру- ки 70% этанолом. Рукава одежды являются основным источником загряз нения, поэтому рукава нужно закатать и обработать открытые участки ко- жи рук 70% этанолом. В качестве альтернативы можно использовать чис- тую одежду, обработанную УФ-лампой, которую не использовали за пре- делами комнаты для пересевов. Горелку Бунзена (или спиртовку) нужно поместить в центр ламинарного бокса, чтобы все операции проводились в пределах зоны с диаметром от пламени в 40см (рис. 7). Сосуд для исполь- зованных пипеток, одноразовых наконечников и других предметов нужно поместить справой стороны от человека (слева, если работает левша), что- бы уменьшить риск загрязнения. После организации рабочего места нужно зажечь горелку (спиртовку) и еще раз обработать руки 70% этанолом, из- бегая воспламенения спирта. Если стерильное оборудование (например, пипетка или одноразовый наконечник) случайно коснется внешних по- верхностей контейнера или другой склянки, его следует выбросить и заме- нить новым стерильным изделием. Содержимое стеклянных сосудов не следует наливать прямо в другой сосуд, если внешнюю поверхность около отверстия невозможно обработать пламенем. Ни при каких обстоятельст- вах нельзя повторно использовать одну и ту же пипетку! Таким же образом порцию стерильной среды, которая остается в пипетке после манипуляций, следует вылить в сосуд для утилизации, не допуская ее разбрызгивания и попадания микроскопических капель в стерильную среду (Kawachi, Noel, 2005).
4.6.2. Пересадка жидких культур водорослей
В настоящее время существует множество вариаций методики пере- сева культур в новую среду. Представленный в данном пособии метод прост и позволяет без особых усилий соблюдать необходимую стериль- ность при работе. Этот способ предполагает наличие ламинарного бокса с вытяжкой, в случае его отсутствия ряд этапов можно пропустить. Кроме того, описанный метод подразумевает использование многоразовых стек- лянных пипеток, при использовании одноразовых пипеток или наконечни- ков необходимы небольшие модификации этого метода. Наконец, реко- мендации разработаны для праворуких людей, леворукие люди должны внести небольшие коррекции (Kawachi, Noel, 2005).
Подготовительный этап. 1. Надеть защитную одежду, стерилизованную в УФ-лучах. Если эта одежда использовалась вне комнаты для пересевов, ее надо занести в ком- нату и включить УФ-лампу.
2. Выключить УФ-лампу, открыть дверь, стараясь широко не распа- хивать, медленно войти в комнату и осторожно закрыть дверь.
3. Включить вытяжку в ламинарном шкафу, если в боксе есть газо- вый кран, открыть его, однако кран горелки Бунзена должен быть закрыт.
4. Протереть рабочую поверхность 70% этанолом.
5. Поместить бунзеновскую горелку в центр. 6. Поставить коробку со стерильными одноразовыми или многоразо- выми пипетками слева как можно дальше (рис. 7).
7. Поставить склянки, колбы Эрленмейера, пробирки слева (на вто- рую позицию в хронологическом порядке использования в соответствии с рис. 7) на периферию в радиусе 40см от горелки Бунзена.
8. Положить грушу для пипеток справа от горелки Бунзена. Необхо- димо регулярно обрабатывать внутреннюю часть груши 70% этанолом и промывать внутреннюю часть отверстия. Никогда не следует использовать грушу, которую применяли для работы с химикатами (например, осмием, глутаральдегидом).
9. Поставить емкость для использованных пипеток на максимальное расстояние от себя справа (вне радиуса 40см от горелки).
10. Проверить наличие этикеток на всех емкостях для пересева. 11. После организации рабочего места необходимо открыть кран и зажечь горелку Бунзена. Обработать руки 70% этанолом или надеть сте- рильные перчатки. Манипуляции проводить внутри зоны на удалении 40см от горелки.
12. Левой рукой нужно взять коробку с пипетками и поднести ее к горелке Бунзена на расстояние 20см. Открыть крышку правой рукой, дер- жа крышку между ладонью и безымянным и указательным пальцами (рис. 8a). Если крышка слишком велика для этих манипуляций, поднести крыш- ку к горелке и подержать в пламени.
13. Левой рукой слегка встряхнуть коробку таким образом, чтобы одна из пипеток вышла из коробки на несколько сантиметров (рис. 8b).
14. Правой рукой взять пипетку большим, указательным и средним пальцами, вытащить из коробки медленным движение (рис. 8с). Наконеч- ник пипетки не должен касаться никаких поверхностей.
15. Держать свои руки вблизи горелки Бунзена, работать с пипеткой и открывать сосуд лучше всего на расстоянии 20см от горелки.
16. Закрыть коробку крышкой, стараясь не допустить касания пипе- ток поверхностей (рис. 8d). Для предотвращения загрязнения во время по- вторных посевов культур, рекомендуется держать коробку с пипетками от- крытой на расстоянии 40см от горелки и доставать пипетки при помощи металлического пинцета, стерилизуемого в пламени перед каждой мани- пуляцией. В этом случае следует использовать все пипетки в коробке, или снова стерилизовать их перед следующим использованием.
17. Левой рукой переместить коробку с пипетками в ее обычное по- ложение.
18. Левой рукой достать пипетку большим и указательным пальцами за конец, закрытый ватной пробкой и поднести к пламени (рис. 9а).
19. Правой рукой взять грушу.
21. Стерилизацию пипетки в пламене проводить не обязательно, од- нако, если это сделали, необходимо остудить пипетку в небольшом коли- честве стерильной среды.
22. Взять пипетку правой рукой возле груши (рис. 9с), а левой рукой – сосуд с культурой.
23. Переместить сосуд с культурой в правую руку, и с помощью ла- дони и мизинца правой руки открыть крышку сосуда, держа пипетку (рис. 10а). Пипетку надо держать вблизи горелки и не касаться никаких поверх- ностей.
24. Левой рукой осторожно поднести отверстие пробирки к пламени и медленно вращать пробирку под углом 45 ?, стараясь не дышать в сторо- ну сосуда с водорослями (рис. 10b). Не нагревать пластиковую посуду!
25. Левой рукой медленно переместить пробирку обратно от пламе- ни, держа под углом 45 ? для уменьшения загрязнения.
26. Медленно опустить наконечник пипетки в жидкость, стараясь не задевать стенок пробирки.
20. Надеть грушу на пипетку (рис. 9b).
27. Медленно набрать суспензию клеток в пипетку с помощью гру- ши, следя за тем, чтобы жидкость не доходила до ватной пробки, закры- вающей пипетку (рис. 10c). Набрать только необходимый объем суспензии водорослей, излишки необходимо вылить. Для уменьшения риска разлива- ния культуры после забора клеток груша должна принять первоначальное расширенное положение.
Рис. 9. Работа с пипеткой Пастера (Kawachi, Noel, 2005): a – перемещение пипетки из правой в левую руку; b – надевание груши на пипетку. Кончик пипетки должен находиться вблизи горелки Бунзена. Ватная пробка пре- дохраняет загрязнение пипетки со стороны груши; c – держа пипетку пра- вой рукой, медленно переместите в левую руку (ее не видно) для отбора культуры водорослей
28. После забора необходимого количества суспензии клеток пипет- ку следует медленно вынуть из пробирки, избегая контакта со стенками.
29. Повернуть пипетку горизонтально без надавливания на грушу и держать ее на расстоянии 20см от горелки Бунзена.
30. Снова поднести горлышко пробирки к пламени, повернуть (рис. 10d), не касаясь пипеткой никаких поверхностей.
31. Левой рукой медленно поднести пробирку к пробке, которую следует держать мизинцем и ладонью правой руки (рис. 10е). Более круп- ные крышки (например, пробки колб Эрленмейера), которые невозможно держать во время манипуляций, необходимо положить на рабочую по- верхность и подержать в пламени перед тем, как закрыть сосуд.
32. Закрыть пробирку крышкой, всегда помня о том, что пипетка не должна касаться никаких предметов и поверхностей. Не подносить пипет- ку близко к пламени, так как высокая температура может убить клетки.
33. Поставить закрытую пробирку на прежнее место. Лучше всего ставить пробирку с культурой на новое место, чтобы не поместить в нее культуру второй раз. Если пробирки находятся в штативе, необходимо разделять пробирки со средой и пробирки с инокулятом свободным рядом (рис. 7).
Рис. 10. Методика работы с пробиркой во время пересева (Kawachi, Noel, 2005). Пробку следует держать между ладонью и маленьким пальцем во время асептической работы: a – открывание пробки; b – обработка гор- лышка пробирки в пламени горелки; c – отбор суспензии клеток для пере- сева; d – повторная обработка горлышка пробирки в пламени; e – закрыва- ние пробирки пробкой
34. Медленно поднести левую руку к сосуду, в который будет вно- ситься суспензия водорослей.
35. Используя те же процедуры, которые были описаны выше, от- крыть новую пробирку, поднести горлышко к пламени и опустить пипетку в новую пробирку, не касаясь стенок.
36. Медленно вылить суспензию водорослей в пробирку и осторожно вытащить пипетку. Если кончик пипетки находится ниже уровня жидко- сти, следует избегать появления пузырьков.
37. Поднести горлышко сосуда к пламени и закрыть крышку так, как было описано выше, соблюдая меры стерильности.
38. Поместить пробирку с водорослями, закрытую крышкой, в штатив.
39. Выбросить использованную пипетку в специальный контейнер, соблюдая меры предосторожности для предотвращения разбрызгивания суспензии клеток на рабочую поверхность. Если разбрызгивание все-таки произошло, вытереть жидкость салфеткой, обработать 70% этанолом и снова протереть поверхность чистой салфеткой. Поменять перчатки или обработать руки 70% этанолом.
40. Поставить пипетку в контейнер для использованных пипеток. Ладонью и указательным пальцем свободной левой руки взять пипетку за конец с ватной пробкой, и осторожно удалить грушу с пипетки правой ру- кой (рис. 11а).
Рис. 11. Удаление остатков жидкости в стакан для утилизации (Kawachi, Noel, 2005): a - грушу следует удалять только тогда, когда пипетка нахо- дится над стаканом для предотвращения попадания жидкости на рабочую поверхность; b – стакан для утилизации должен быть устойчивым, чтобы при помещении в него большого количества пипеток он не опрокинулся; в стакане должно быть достаточное количество воды для его устойчивости и для того, чтобы кончики пипеток находились в жидкости.
41. Левой рукой поместить пипетку в контейнер, следя за тем, чтобы наконечник был полностью погружен в воду (рис. 11b). Вернуть грушу в нормальное положение. Рабочее место должно быть готово к следующему процессу инокуляции.
42. После окончания пересева выключить горелку Бунзена, уб- рать все материалы с рабочего места, и протереть все поверхности 70% этанолом.
43. Закрыть основной газовый кран, если он есть. Выключить систе- му вентиляции и включить УФ-лампу. Выйти из комнаты, осторожно от- крывая и закрывая дверь.
44. Снять защитную одежду и положить в специальный шкаф для стерилизации.
45. Лучше всего иметь специальную чистую обувь для пересевов. Перед входом в стерильную комнату для пересевов нужно положить ков- рик для протирания обуви. Грязь с обуви является одним из основных ис- точников загрязнения.
46. Перед допуском к работе необходимо проводить инструктаж и объяснять все правила соблюдения стерильности. Только после этого ис- следователя можно допускать к пересеву культур (Kawachi, Noel, 2005).
4.6.3. Пересадка агаровых культур
Процедура пересадки агаровых культур имеет ряд особенностей, но в це- лом характеризуется большим сходством с пересадкой жидких культур: 1-5. Эти пункты аналогичны методике пересадки жидких культур. 6. Положить микробиологическую петлю возле горелки Бунзена. Поставить пробирки или чашки Петри слева на периферию радиуса 40см от горелки.
7. После организации рабочего места повернуть газовый кран и за- жечь горелку Бунзена. Надеть стерильные перчатки или протереть руки 70% этанолом. С этого момента начинаются стерильные манипуляции, по- этому нужно работать внутри радиуса 40см вокруг горелки Бунзена.
8. Нагреть микробиологическую петлю в синей части пламени го- релки Бунзена до тех пор, пока металл не раскалится (рис. 12а).
9. Остудить петлю внутри зоны 20см от горелки Бунзена (рис. 12b). 10. Левой рукой переместить пробирку с культурой по направлению горелки внутрь зоны 2см от горелки.
11. При работе с пробиркой следуйте инструкции для пересадки жидких культур (см. п. 23-25). При работе с чашками Петри открыть крышку левой рукой под углом 45 ?, избегая касания внутренней части крышки (рис. 12с).
12. Медленно опустить петлю в пробирку и осуществить забор не- большого количества культуры, не царапая агар (рис. 12d).
13. Закройте крышку пробирки или чашки Петри крышкой (см. п. 30- 32 инструкции по пересеву жидких культур).
14. Медленно поднести свою левую руку к сосуду, в который будет пересаживаться культура.
15. Используя процедуру, описанную выше, открыть новый сосуд и аккуратно пересадить культуру на поверхность агара, не царапая ее. Ис- пользовать подходящую технику пересева (например, горизонтальные зиг- загообразные движения для пробирки или метод квадратов для чашки Петри). В любом случае, конец микробиологической петли не должен ка- саться стенок пробирки или чашки Петри.
Рис. 12. Пересев культур водорослей на агаризованные среды (Kawachi, Noel, 2005): a – нагревание платиновой петли в пламени горелки Бунзена; b – охлаждение микробиологической петли вблизи горелки Бунзена; c – от- крывание чашки Петри под углом 45 ?; d – посев культуры в пробирку, при этом следует избегать контакта петли со стенками пробирки, пробирку следует держать под углом 45 ? к поверхности
16. После пересева горлышко пробирки нагреть в пламени горелки и закрыть крышкой так, как описано выше, используя меры стерильности. При пересеве в чашки Петри закрыть крышку чашки Петри очень осто- рожно.
17. Нагреть конец микробиологической петли в синей части пла- мени до тех пор, пока металл не накалится. После остывания петли внутри зоны 20см от горелки петля готова к следующему пересеву.
18. Далее необходимо следовать инструкциям, приведенным в мето- дике пересева жидких культур (см. п. 42-46) (Kawachi, Noel, 2005).
1. При посеве в жидкую питательную среду петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.
2. При посеве на скошенный мясо-пептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прикасаясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериальной петли, посредством которой производится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынимания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха.
Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой (рис. 4).
3. При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают I и II пальцами, а с другой — IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют I и III или I и II пальцами. Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки (рис. 5). Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на несколько равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микроорганизмов.
Рис. 5. Посев на плотную питательную среду в чашки Петри
Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользоваться вместо петли тампоном или шпателем.
При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного, или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида.
4. Из материала, подлежащего посеву в толщу плотной питательной среды, готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изотоническом растворе. Набирают 0,1—1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15—20 мл мясо-пептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40—45°С (при такой температуре пробирка со средой, приложенная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в питательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола.
5. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.
Получение чистых культур
Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной микробной колонии. Под микробной колонией подразумевается потомство бактерий, возникающее в результате размножения одной микробной клетки.
Выделение чистой культуры микробов является обязательным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культур культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.
Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение получил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды.
Очень широко применяются элективные питательные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить.
Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воздействию определенных факторов внешней среды. Индивидуальная устойчивость микробов к тому или иному фактору была использована для разработки методов выделения чистых культур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споpoвых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отличие от остальных микробов, содержащихся в мокроте.
При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных животных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологический метод выделения чистой культуры применяется при исследовании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.
Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры. Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но из их скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то к ней часто прикрепляются посторонние формы. В случае выделения штаммов Bacillus или актиномицетов контаминирующие микроорганизмы могут быть опутаны цепочками клеток или, соответственно, гифами этих микробов. Для очистки предпочтительнее использовать неселективную среду, поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить. Но даже на неселективной среде не следует очень быстро отбирать колонии, поскольку за данный отрезок времени могут не вырасти медленно растущие контаминирующие бактерии.
Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии и при микроскопировании выявляются похожие клетки, в частности, по размеру и окраске по Граму. Однако возможны исключения, например, колонии, вырастающие из чистой культуры, могут быть гладкие (S) и шероховатые (R). Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться кокковидные клетки, цисты и споры. Наконец, некоторые микроорганизмы проявляют грамвариабельность. Тем не менее, указанные критерии широко используются при определении чистоты культур.
Посев штрихом
В Г Д
Рис. 6. Удобный метод посева штрихом в чашки для получения отдельных колоний. А. Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно на 3 сектора. Б. Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности агара в секторе 1, как показано на рисунке. Для этого крышку чашки сначала приподнимают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15 с). В. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 1, как показано на рисунке, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2. Прогревают петлю в пламени и дают ей остыть. Г. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2, как показано, и затем наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3. Д. Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки, как показано на рисунке, для того, чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала на поверхность агара. В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолированные колонии.
Посевом называют внесение культуры микроорганизмов (инокулята) в стерильную питательную среду. Пересев заключается в переносе культуры микроорганизмов, выращенной на одной питательной среде, на другую свежую питательную среду. Посевы и пересевы осуществляют в боксе, при этом ограничивают движения, возбуждающие движение воздуха. Во время посевов и пересевов соблюдают требования личной безопасности.
Техника посева зависит от консистенции питательной среды, характера засеваемого материала и цели исследования. Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовывать в кольце петли тонкую прозрачную пленку. Петлю с находящимся на ней материалом погружают в питательную среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой.
Пипетками (пастеровскими или градуируемыми) пользуются в том случае, когда материал засевают питательную среду в большом или точно отмеряемом объеме.
Посев микроорганизмов из пробирки в пробирку. При пересеве из одной пробирки в другую обе пробирки держат в наклонном положении в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы все операции осуществлялись под контролем глаза. Причем пробирку, из которой берут посевной материал, держат ближе к себе. Пересевы проводят над пламенем горелки, чтобы не допустить попадания в посевной материал посторонних микроорганизмов из воздуха.
Перед посевом прокаливают докрасна проволоку бактериологической петли и обжигают примыкающую к петле часть держателя. Петлю держат вертикально в пламени горелки, чтобы вся проволока была раскалена. После прокаливания петлю остужают, прикасаясь к внутренней поверхности пробирки. Пробки обеих пробирок одновременно захватывают мизинцем и мякотью ладони правой руки и плавно, легкими винтовыми движениями извлекают над пламенем горелки. Затем петлей или пипеткой материал переносят из одной пробирки в другую, не касаясь стенок, и распределяют в питательной среде.
Петлю и пипетку держат как авторучку. Пипетку извлекают из упаковки за верхний конец, берут средним или большим пальцем правой руки, не касаясь той части пипетки, которая будет контактировать с инокулятом или питательной средой.
Во время работы пробирки следует держать в наклонном положении, чтобы в исследуемый материал или в стерильную среду не попали посторонние микроорганизмы из воздуха или посторонних предметов. При этом необходимо следить, чтобы среда не касалась пробки и не вылилась. Окончив посев, петлю прожигают, чтобы уничтожить оставшиеся на ней микроорганизмы, и ставят в штатив. Пробирки одновременно закрывают, предварительно профламбировав их края и ту часть пробок, которая входит в горлышко пробирки. Использованные пипетки, не касаясь окружающих предметов, опускают в сосуд с дезинфицирующим раствором (1%-2% водный раствор хлорамина или 5% водный раствор фенола).
В верхней части пробирок карандашом по стеклу (стеклографом) подписывают название засеянного материала, ставят номер анализа или проставляют дату посева.
Посев микроорганизмов из пробирки в чашки Петри. Пробирку держат в наклонном положении в левой руке между большим и указательным пальцем. Правой рукой берут петлю или пипетку. Непосредственно перед взятием материала бактериальную петлю прокаливают на огне. Для того чтобы остудить горячую петлю, ее погружают в конденсационную жидкость внутри пробирки или прикасаются к поверхности питательной среды свободной микроорганизмов (остуженная петля при соприкосновении с агаровой средой не вызывает ее расплавления). Мизинцем и мякотью ладони правой руки вынимают пробку из пробирки. Края пробивки при вынимании пробки прожигают. Набирают материал для посева и вносят его в чашку Петри.
Чашки Петри при пересеве должны лежать на столе вверх крышкой. Крышку фиксируют большим, средним и указательным пальцами и приоткрывают настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно входили петля или пипетка. Полностью крышку с чашки Петри во время работы не снимают во избежание попадания посторонних микроорганизмов в стерильную питательную среду или исследуемый материал.
Посевной материал из пипетки выливают на питательную среду в центр чашки Петри и распределяют его шпателем Дригальского или посредством разного наклона чашки. Если посевной материал взят петлей, то его размазывают по поверхности плотной питательной среды. При этом диск петли должен плашмя лежать на поверхности среды, а посев проводят без нажима, чтобы не повредить питательную среду.
После окончания посева на чашках Петри со стороны дна стеклографом подписывают название засеянного материала, ставят номер анализа или проставляют дату посева.
Посев на скошенный питательный агар. Петлю с находящимся на ней материалом вводят в пробирку до дна, опускают на питательную среду плашмя и скользящим движением от границы конденсата проводят зигзагообразную линию.
Посев шпателем на среду в чашки Петри. Исследуемый материал петлей наносят на поверхность питательной среды у края чашки и затем шпателем или тампоном распределяют его равномерно по всей поверхности. Надавливать на питательную среду не следует, так как ее можно повредить. По окончании посева стеклянный шпатель или тампон помещают в дезинфицирующий раствор, а металлический прокаливают в пламени горелки.
При посеве шпателем микроорганизмы дают сплошной или газонный рост. Посев газоном производят в том случае, когда необходимо получить большое количество микробной культуры одного вида.
Посев уколом в столбик питательной среды.Пробирку с питательной средой, застывшей в виде столбика, берут в левую руку, как обычно. Переворачивают кверху дном и в центре столбика снизу до Д на вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.
Читайте также: