Посев на мясопептонный агар
Добавил пользователь Евгений Кузнецов Обновлено: 19.09.2024
Почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Образцы почвы, доставленные в лабораторию, освобождают от крупных примесей –стекол, камней, корней и др. Крупные комочки почвы измельчают, затем образцы пропускают через сито с диаметром отверстий не более 3 мм, объединяют и из этой смеси берут навеску 10г.
Приготовленную навеску вносят в колбу с 90 мл стерильной дистиллированной воды и тщательно перемешивают взбалтыванием в течение 5-10 мин. Такая обработка необходима для того, чтобы извлечь микроорганизмы из комочков земли и с поверхности почвенных частиц. Полученную равномерную взвесь отстаивают 2 мин и затем готовят из нее ряд 10-кратных разведений, последовательно перенося стерильной пипеткой по 1 мл в пробирки с 9 мл стерильной дистиллированной воды. Схема последовательных разведений почвы представлена на схеме. При приготовлении разведений взвесь переносят в каждую последующую пробирку новой стерильной пипеткой. Таким образом, готовят разведения до 1:1000000 и более в зависимости от того, из каких почв были взяты пробы для исследования, и их предполагаемой заселенности микроорганизмами. Для посева используют не менее двух различных разведений (обычно используют два последних, максимальных). Из каждого выбранного разведения по 1 мл вносят в 2 стерильные чашки Петри (для получения средних показателей) и заливают 15-20 мл расплавленного и охлажденного до 45ºС МПА. Осторожно передвигая чашки по поверхности стола, перемешивают агар с внесенными в него разведениями почвы. После застывания питательной среды чашки инкубируют в термостате при температуре 30-35ºС в течение 24 - 48 ч. Количество микроорганизмов, содержащихся в 1г исследуемой почвы, определяют следующим образом. Подсчитывают количество колоний, выросших на каждой из двух чашек, суммируют полученные результаты и делят на 2, вычисляя среднеарифметический показатель, и умножают его на степень разведения. Для подсчета берут чашки, на которых выросло от 50 до 150 колоний. Пример. В чашках, засеянных почвенной суспензией, взятой из разведения 1: 10000, выросли в среднем 75 колоний. 75 умножаем на степень разведения - 10000 и получаем результат - 750000 бактерий. То есть такое количество микроорганизмов содержится в 1 г исследуемого образца почвы.
Схема последовательных разведений почвы.
Определение общего количества бактерий группы кишечной палочки - БГКП
Методика. Различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера (1л дистиллированной воды, 10 г пептона, 50 мл бычьей желчи, 10 г лактозы; рН 7,4-7,6; 4 мл 1% водного раствора генцианового фиолетового). Разливают в пробирки с поплавками. Инкубируют при 43°С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках Гр - палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная (изменение окраски на синий цвет) проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие Е. coli.
Определение наличия Cl. perfringens
Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. Инкубация при 43°С 48 часов. Учитывают результаты по образованию черных колоний Cl. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (Гр+ крупные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почернению и разрыву среды впервые 12 часов роста при 43 0 С).
К работе № 4
К 100 мл мясного бульона добавляют 1 % пептона Пептон- это продукт ферментативного гидролиза белков. Добавляют пептон в среду для увеличения ее питательности, для уплотнения среды в нее добавляют от 2 до 4 % агар-агара
Питательная среда д.б. слабокислой по отношению к цитоплазме микроорганизмов, которые будут выращиваться в ней. Для этого в среду добавляют 0,5% поваренной соли. Реакция среды от 7,0 до 7,4. После введения агар-агара смесь прогревают до неполного студнеобразования.
Приготовление мясо-пептонногожелатина.
Эта среда готовится аналогично МПА, но для уплотнения ее применяют на агар-агар, желатин в количестве 10-12% . МПЖ имеет ряд преимуществ перед МПА. Он Лучше соединяется со стеклом, гнилостные бактерии образуют при росте на этой среде весьма характерные колонии, кроме того, некоторые из гнилостных бактерий обладают способностью разжижать желатин, что очень важно для определения вида бактерий. Но МПЖ' плавится при температуре 30-37 0 С, в этом его недостаток.
Дня изучения биохимических признаков микроорганизмов пользуются дифференциально-фагностическими средами. Примером таких сред могут служить среды Гисса. Их применяют для изучения способности м.о. ферментировать углеводы.
В состав сред Гисса входит 1% какого-либо углевода, 1% агар-агара и индикатор. Примером такой среды является и среда Эндо, применяемая для выделения Bact. coli. В состав этой среды входит, кроме МПА, насыщенный спиртовой раствор фуксина, 1% лактозы Na2SO3 , рН 7-7,2 Bact. coli дает на среде Эндо колонии с металлическим блеском. Для изучения плесневых грибов используют среду Сабуро, следующего состава: 1% глюкозы, 1% пептона, 2% агар-агара рН 5-5.6.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:
Приготовить 100 мл МПА:
1. В кастрюлю напивают воду и ставят на горелку - готовят водяную баню.
2. В колбу наливают 100 мл МБ. Взвешивают 2 г. пептона. 0,5 г. агар-агара. Все это помещают в колбу с мясным бульоном.
3. Колбу ставят в кастрюлю с горячей водой и содержимое колбы подогревают до тех пор пока полностью не расплавится агар-агар и среда не станет однородной. Затем добавляют соды (до слабощелочной реакции по лакмусу).
4. Расплавленную среду разливают в пробирки по 10 мл.
5. Готовят ватные пробирки, обтягивают их марлей и закрывают пробки с приготовленной питательной средой.
6. Пробирки с МПА помещают в корзины. Сдают лаборанту для стерилизации.
Классификация питательных сред
По составу питательную среду подразделяют на 2 группы: натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды.
Синтетические среды - это такие среды в состав которых входят только определенные , химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть довольно простыми по составу. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена
По назначению : различают элективные и дифференциально-диагностические среды
Элективные среды обеспечивают развитие преимущественно одного вида м.о. или группы родственных микроорганизмов (менее пригодны или совсем не пригодны для развития других). Такие среды применяют главным образом для выделения.
Микроорганизмов из мест их естественного обитания, для получения накопительных культур.
Дифференциально-диагностические среды: это такие среды, которые позволяют по возможности очень быстро отличить (дифференцировать) одни виды м.о. от других. Их состав подбирается с таким расчётом, чтобы он позволил чётко выявить наиболее характерные свойства данного вида м.о. Нередко это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов.
По физическому состоянию среды разделяют на жидкие, плотные и сыпучие. Для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используют для выделения чистых культур. В промышленной биологии применяют так называемые сыпучие среды. К ним относятся разваренное пшено, пропитанное питательным раствором.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что принято считать питательными средами?
2. Как классифицируют их по агрегатному состоянию?
3. Как делятся питательные среды по назначению? В каких случаях удобнее применять те или иные среды?
4. Какие среды называют дифференциально-диагностическими?
5. Как готовят питательные среды? Какие студнеобразователи чаще всего применяют?
Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ
а) Пересев из колоний на скошенный агар
Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды. Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.
б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон
Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду. При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенку сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.
Методические указания к практической работе
Выделение отдельных видов бактерий из исследуемого материала является одним из этапов любого бактериологического исследования.
Обычно для выделения чистой культуры затрачивают 3-4 дня, но в некоторых случаях это время удлиняется, например, для выделения туберкулезных бактерий нужно 4-6 недель.
Первый этап
Посев исследуемого материала. Прокаленной остуженной петлей берут материал из пробирки (задача №. ) и распределяют по поверхности среды петлей, нанося параллельные штрихи на расстоянии 0,4-0,6 см один от другого, от одного края чашки к другому, держа петлю плашмя, чтобы не поцарапать питательную среду. Чашки подписывают (название материала, фамилия, дата посева) со стороны дна и помещают в термостат дном кверху, чтобы капельки конденсата, образующиеся на крышке, не стекали на среду и не размывали посевы.
Второй этап
Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Так как материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии, очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их. Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет; полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).
1. Sedykh, T.A. GH and DGAT1 gene polymorphism effect on beef production traits of Hereford and Limousine bull calves / T.A. Sedykh, E.A. Gladyr, R.S. Gizatullin, I.V. Gusev, I.Yu Dolmatova, L.A. Kalashnikova // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. – 2016. – №8 (1). – 1425 – 1435.
2. Sedykh, T.A. Influence of TG5 and LEP gene polymorphism on quantitative and qualitative meat composition in beef calves / T.A. Sedykh, L.A. Kalashnikova, I.V. Gusev, I.Yu. Pavlova, R.S. Gizatullin, I.Yu. Dolmatova // Iraqi Journal of Veterinary Sciences. – 2016. – Т. 3, – № 2. – С. 41–48.
3. Алехина, Л.Т. Технология мяса и мясопродуктов. [Текст]/ Л.Т. Алехина А.С. Большаков, В.Г. Боресков [и др]. / п. ред. И.А. Рогова. – Москва: Агропромиздат, 1988. – С.576
4. Антипова, Л.В. Дипломное проектирование. [Текст]/ Л.В. Антипова, И.А. Глотова, Г.П. Казюлин – Воронеж: ВГТА, 2001. – С.584.
5. Антипова, Л.В., Методы исследования мяса и мясных продуктов. [Текст]/ Л.В. Антипова, И.А. Глотова, И.А. Рогов – Москва: Колос, 2001. – С.266 – 292.
6. Бредихин, С.А. Технологическое оборудование мясокомбинатов [Текст]/ С. А. Бредихин, О. В. Бредихина, Ю. В. Космодемьянский – 2-е изд., испр. – Москва: Колос, 2000. – 392с.
7. Житенко П.В. ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов животноводства. [Текст]/ П.В. Житенко, М.Ф. Боровков – Москва: Колос, 2000. – 286с.
8. Журавская, Н.К. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов. [Текст]/ Журавская Н.К., Алехина Л.Т., Отряшенкова Л.М. – Москва: Агропромиздат, 2004. – 293с.
9. Ивашов В.И. Технологическое оборудование предприятий мясной промышленности. [Текст]/ В.И. Ивашов – Москва: Колос, 2001. – 552 с.
10. Рогов, И.А. Общая технология мяса и мясопродуктов. [Текст]/ И.А. Рогов, А.Г. Забашта, Г.П. Казюлин – Москва: Колос,2000. – 376с.
Введение. Содержание основных питательных веществ в мясе во многом определяет его пищевые достоинства и вкусовые качества. Качество мяса зависит от многих факторов среди которых вид животного, его генотип, направление продуктивного использования, интенсивность эксплуатации, условия кормления, содержания и многое другое [1,2]
В настоящее время в изучении качества мяса широко используется химический, физико-химический и микробиологический методы, оценки, которые в комплексе позволяют более объективно судить о питательности мяса. Большое значение при переработке мяса уделяется изучению микробиологических показателей. Данное исследование позволяет определить количество вредных бактерий в сырье и в готовой продукции, которые опасны для употребления и определить качество продукции [5].
группы кишечной палочек, патогенные, в том числе сальмонеллы.
Определения бактерий группы КМАФАнМ, БГКП и Salmonella в сырье:
Методика определения КМАФАнМ:
Готовится мясопептонный агар. Мясопептонный агар (МПА). К готовому бульону (до стерилизации или после нее) добавляют 2-3% измельченного агар-агара и кипятят, помешивая, на слабом огне до полного расплавления агара. МПА можно варить в автоклаве или аппарате Коха. Готовую среду, если нужно, осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 мин при 120° С [7].
Методика определения БГКП:
Готовится среда КЕССЛЕРА-ГРМ. 23,0 г препарата размешивается в 1 л дистиллированной воды. Кипятят 2-3 мин, фильтруется через бумажный фильтр, разливается по 5 мл в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуется автоклавированием при температуре 112 °С в течение 20 мин. Готовая среда имеет фиолетовый цвет. Стерильную среду можно использовать в течение 4-х недель при условии ее хранения при температуре
2-8C, в темном месте [9].
Среда Эндо. Состав среды Эндо: пептона — 1%, лактозы — 1 %, двузамещенного фосфорнокислого калия (К2НРO4) — 0,35%, агар-агара — 1,5%. Все ингредиенты, за исключением лактозы, растворяются в воде при кипячении или в автоклаве. Во избежание карамелизации сахара, лактоза добавляется после растворения всех остальных компонентов ставят на 20 часов в термостат при температуре 37°С и через данное время смотрят на сколько данное сырье загрязненно [10].
Методика определения Salmonella.
С готовой продукции проводятся такой же процесс, но кроме КМАФАнМ, БГКП, Salmonella определяется S.aureus, Listeria monocytogenes, Сульфитрадуцциющие кластридии. Также отталкиваемся на нормативные документы.
Методика определения S.aureus.
Определения количества S.aureus методом наиболее вероятного числа проводится на высеве анализируемой пробы продукта, инкубация, после проводится учет положительных пробирок и подтверждении выявленных микроорганизмов [5,8].
Методика определения Listeria monocytogenes.
Для определения Listeria monocytogenes берем 100 см растопленного и охлажденного до 45-50 °С МПА с 1% глюкозы добавляется 5-10 см стерильно взятой дефибринированной крови животных. Смесь осторожно окрашен в красный цвет. Среда подсушивается при (37±1) °С и хранят не более 2 сут при температуре (4±1) °С. Среда должна иметь рН 7,2-7,4.Для посева используются теплые чашки. Навеса 25гр. данного продукта посевается в чашку Петри с данной средой и оставляют в термостате на 24 часа при температуре 37?С. Проводится итог и сравнивают с нормативным документом [4].
Методика проведения Сульфитрадуцциющие кластридии.
Железо-сульфитный агар. Для приготовления потребуется 42 гр. железо-сульфитного порошка, разводится с 1 литром дистиллированной водой. Вскипятить и разлить в пробирки. Стерилизовать автоклавированием 15 минут при температуре 121ºС. В чашку Петри заливается 15 мл среды. Смешивается инокулят со средой и дают застыть, после застывания заливается сверху еще 10 мл и дают остыть после проводят посев и ставят в термостат на 24 часа при температуре 37?С. Определяют количества Сульфитрадуцциющие кластридии [3].
Результаты исследования. При оценке качества мясного сырья определяли количество КМАФАнМ, БГКП, Salmonella. Сырье как правило может быть загрязнено данными бактерииями, так как оно хранится, транспортируется и перемещается. Существуют нормативы по количества бактерий в различных видах сырья, которые погибают при приготовления готовой продукции, так как проходит определенный температурный режим готовки.
В таблице 1 приводятся нормы микробиологических показателей по нормативным документам ГОСТ 10444.15, ГОСТ Р 52816, ГОСТ Р 52814-2007, ГОСТ Р 51921-2002, ГОСТ 52815-2007[4].
ГОСТ 31747-12г.- Продукты пищевые. Методы оопределения и выявления количества бактерий групп кишечных палочек
ГОСТ 10444.15-94г.- Продукты пищевые. Методы определения КМАФАнМ
ГОСТ 31659-12г.- Продукты пищевые. Методы выявления бактерий рода Salmonella.
Таблица 1. Микробиологические показатели сырья по нормативным документам
КМАФАнМ, КОЕ/г,
не более
Масса продукта (г),
в которой не допускаются
группы кишечной палочки (колиформы)
патогенные, в том числе сальмонеллы
Мясо свежее (все виды убойных животных), мясо парное в отрубах (полутуши, четвертины) охлажденное и переохлажденное
Читайте также: