Коли титр воды определяют при посеве на среду

Добавил пользователь Cypher
Обновлено: 18.09.2024

Метод мембранной фильтрации

ТН ВЭД 220100000

Дата введения 2014-01-01

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены".

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Обществом с ограниченной ответственностью "Протектор" совместно с Федеральным государственным бюджетным учреждением "Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина" на основе собственного аутентичного перевода, указанного в пункте 4 международного стандарта

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 343 "Качество воды")

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2013 г. N 43-2013)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Госстандарт Республики Казахстан

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

- изменения структуры. Сравнение структуры международного стандарта со структурой настоящего стандарта приведено в приложении ДА;

- внесения дополнительных положений, фраз и слов, что обусловлено учетом потребностей национальной экономики и особенностей межгосударственной стандартизации, выделенных в тексте настоящего стандарта курсивом*.

* В оригинале обозначения и номера стандартов и нормативных документов в разделе "Предисловие", приложении ДА, таблице ДБ.1 приложения ДБ приводятся обычным шрифтом, остальные по тексту документа выделены курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

Положения, выделенные в тексте стандарта вертикальной линией, расположенной слева от текста, заменяют ссылку на международный стандарт ISO 8199:1988.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (подраздел 3.6).

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в приложении ДБ.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52426-2005

5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2012 г. N 1904-ст межгосударственный стандарт введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2014 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты"

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты"

ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 11, 2015 год

Поправка внесена изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод обнаружения и количественного учета Escherichia coli (далее - E.coli) и колиформных бактерий в воде, предназначенной для потребления человеком (далее - питьевой воде), в стандартных условиях испытаний (далее - стандартный тест) и при ускоренных испытаниях (далее - ускоренный тест).

Стандартный тест основан на мембранной фильтрации пробы питьевой воды с последующим культивированием отфильтрованных микроорганизмов на дифференцирующей агаризованной среде и вычислении количества E.coli и колиформных бактерий в пробе. В стандартном тесте используют среду с низкой селективностью для обнаружения поврежденных при подготовке питьевой воды бактерий. Вследствие низкой селективности среды фоновый рост микроорганизмов может отрицательно влиять на достоверность количественного учета микроорганизмов, например в водах неглубоких колодцев, не прошедших обеззараживания. Поэтому стандартный тест предназначен для испытаний воды, прошедшей обеззараживание, или воды с низкой численностью бактерий, качество которой соответствует первому классу подземных источников по ГОСТ 2761.

Ускоренный тест предназначен для обнаружения в питьевой воде E.coli в течение 24 ч при необходимости быстрого получения результатов испытаний. Ускоренный тест также основан на мембранной фильтрации пробы питьевой воды с последующим культивированием отфильтрованных микроорганизмов на селективных средах и вычислении количества E.coli в пробе.

Настоящий стандарт может быть использован и для других типов воды при условии, что взвешенные вещества и фоновая микрофлора не оказывают отрицательного влияния на фильтрацию, культивирование и учет микроорганизмов.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 2761-84 Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения. Гигиенические, технические требования и правила выбора

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 5830-79 Реактивы. Спирт изоамиловый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 17626-81 Казеин технический. Технические условия

ГОСТ 18300-87* Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
_______________

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000 "Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия".

ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31942-2012 (ISO 19458:2006) Вода. Отбор проб для микробиологического анализа

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями, включающие признаки и характеристики бактерий:

3.1 лактозоположительные бактерии (lactose-positive bacteria): Бактерии, способные к образованию колоний в аэробных условиях при (36±2) °С на селективной дифференцирующей лактозной культуральной среде с образованием кислоты в течение (21±3) ч при испытании по стандартному тесту.

3.2 колиформные бактерии (coliform bacteria): Лактозоположительные бактерии, являющиеся оксидазоотрицательными при испытаниях по стандартному тесту.

3.3 Escherichia coli (E.coli): Колиформные бактерии, которые продуцируют также индол из триптофана при (44,0±0,5) °С в течение (21±3) ч при испытаниях по стандартному тесту.

3.4 Escherichia coli (E.coli): Устойчивые к желчи бактерии, которые продуцируют также индол из триптофана при (44,0±0,5) °С в течение (21±3) ч при испытаниях по ускоренному тесту.

Примечание - Дополнительная характеристика колиформных бактерий и E.coli приведена в приложении А.

4 Сущность метода

4.1 Основные положения

Сущность метода заключается в фильтровании проб питьевой воды заданного объема через мембранные фильтры, инкубации отфильтрованных микроорганизмов на заданных средах в заданных условиях, идентификации выросших колоний, их количественной оценке и подтверждении этой оценки с помощью стандартного и (или) ускоренного тестов.

Стандартный тест предусматривает инкубацию мембраны на селективной среде с последующим биохимическим подтверждением типичных лактозоположительных колоний, позволяющим обнаружить и провести количественный учет колиформных бактерий и E.coli в течение 2-3 сут.

Ускоренный тест состоит из двух этапов инкубации, позволяющих обнаружить и провести количественный учет E.coli в течение (21±3) ч.

4.2 Фильтрация и инкубация

Исследуемые объемы пробы питьевой воды фильтруют через мембраны, удерживающие микроорганизмы.

Коли-индекс, коли-титр - это количественные показатели фекального загрязнения воды, почвы, пищевых продуктов и других объектов внешней среды. В качестве индикатора фекального загрязнения используется постоянный обитатель кишечника человека — кишечная палочка, так как она легко выращивается в обычных условиях на простых питательных средах. Количество этих бактерий позволяет судить о степени фекального загрязнения исследуемого объекта.

Коли-индекс — количество особей кишечной палочки, обнаруживаемое в 1 л (для твердых тел в 1 кг) исследуемого объекта; определяется путем подсчета колоний кишечной палочки, выросших на плотной питательной среде при посеве определенного количества исследуемого материала, с последующим пересчетом на 1 л (кг). Коли-индекс — величина, пропорциональная фактическому содержанию кишечной палочки в исследуемом субстрате.

Коли-титр — это наименьшее количество исследуемого материала в миллилитрах (для твердых тел — в граммах), в котором обнаружена одна кишечная палочка. Для определения коли-титра раздельно засевают на жидкие среды десятикратно уменьшающиеся объемы исследуемого материала (например, 100; 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001 мл).

Для перевода коли-титра в коли-индекс следует 1000 разделить на число, выражающее коли-титр; для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 разделить на число, выражающее коли-индекс.

По техническим соображениям более часто практикуется определение коли-титра.

Определение коли-титра (коли-индекса) — важный критерий при санитарно-гигиенической оценке воды, пищевых продуктов и напитков.

Определение титра кишечной палочки методом мембранных фильтров. Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема воды на мембранных фильтрах с подращиванием их на среде Эндо при 37 о С, дифференцированием выросших колоний и последующим подсчетом количества бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды.

Первый день. 1. Подготовка мембранных фильтров. Для фильтрования воды отбирают мембранные фильтры № 3 (без изъянов), помещают их в подогретую до температуры 80°С дистиллированную воду и ставят на слабый огонь до закипания. Кипячение фильтров производят трижды по 10 мин. После первого и второго кипячения воду сливают. После последнего кипячения воду не сливают и фильтры оставляют в ней до употребления.

2. Подготовка фильтровального аппарата. Перед посевом воды фильтровальный аппарат протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и обжигают в целях стерилизации. На охлажденный после прожигания столик фильтровального аппарата помещают с помощью стерильного пинцета с гладкими кончиками мембранный фильтр. Во избежание повреждения фильтра под него подкладывают кружок стерильной фильтровальной бумаги. Если вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток фитопланктона, ее сначала фильтруют через предварительный фильтр № 6, помещая его поверх фильтра № 3.

На фильтровальный столик с положенными на него фильтрами устанавливают и закрепляют верхнюю часть прибора - воронку.

3. Фильтрование воды. В воронку фильтровального аппарата стерильно наливают исследуемый объем воды и с помощью водоструйного насоса создают вакуум в приемном сосуде.

При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, необходимо брать объем не менее 333 мл. При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3-4 десятикратных объема. Например, из водопроводной сети можно фильтровать 3; 30; 100; 200 мл воды, на этапах очистки - 0,1; I; 10; 100 мл.

Фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через один фильтровальный аппарат, меняя каждый раз фильтры. При фильтровании небольших объемов воды (1 мл и меньше) в воронку сначала наливают 10 мл стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду. По окончании фильтрования снимают воронку прибора, фильтр захватывают обожженным пинцетом и накладывают на поверхность среды Эндо в чашки Петри.

Второй день. 1. По окончании инкубации производят просмотр посевов:

б) при обнаружении на фильтре колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых и прозрачных), исследование продолжают. Из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют. Отсутствие в мазках грамотрицательных, неспороносных палочек является основанием для прекращения анализа с регистрацией отрицательного результата.

При обнаружении в мазке грамотрицательных палочек, морфологически сходных с кишечной (возможны удлиненные, нитевидные формы или крупные полярно окрашенные палочки), ставится оксидазная проба.

2. Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomanadaсеае и других водных сапрофитов, которые в отличие от кишечных бактерий вырабатывают фермент оксидазу, окисляющую фенилен-диаминовые соединения до индофенола, имеющего ярко-синий цвет.

Для постановки оксидазного теста мембранные фильтры с выросшими на них колониями переносят (не переворачивая) на лист фильтровальной бумаги, предварительно смоченный реактивом для выявления оксидазы (рец. 32). Результат реакции учитывают через 2-4 мин.

Колонии микроорганизмов, продуцирующие оксидазу (не относящиеся к семейству кишечных бактерий), при взаимодействии с добавленным реактивом, приобретают синий ободок при периферии или окрашиваются в синий цвет полностью (положительная реакция).

Колонии семейства Enterobacteriaceae, не продуцирующие фермент оксидазу, не изменяют своего первоначального цвета (отрицательная реакция).

При обнаружении на мембранных фильтрах однотипных лактозоположительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него), не вырабатывающих оксидазы, анализ воды заканчивается на данном этапе подсчетом выросших колоний.

При обнаружении на мембранных фильтрах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью, их подсчитывают и подтверждают принадлежность к бактериям группы кишечных палочек посевом 2-3 изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой (Рец. 44). Результаты роста учитывают через 4-5 ч инкубации в термостате при 37°С. При образовании кислоты и газа результат считается положительным, при отсутствии кислото- и газообразования - отрицательным. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета результатов роста через 24 ч. При отсутствии газообразования через сутки получают окончательный отрицательный результат, при наличии газообразования - положительный результат.

Вычисление коли - индекса. Результат выражают в виде коли-индекса, определяемого посредством суммирования колоний кишечных палочек, выросших на поверхности мембранных фильтров в одной пробе воды, и пересчитывают это количество на 1 л воды.

Пример. При исследовании пробы воды профильтровано 3 объема по 100 мл. Па первом и втором фильтрах выросло по 3 колонии, на третьем- 9 колоний. Всего выросло 15 колоний. Таким образом, коли-индекс исследуемого образца воды равен: 1000 X 15 : 300 = 50.

Питьевая вода удовлетворяет требованиям ГОСТ 2871-82 в том случае, когда коли-индекс не превышает 3.

При установлении бактериальной загрязненности воды свыше допустимых норм прибегают к повторному исследованию воды на наличие бактерий свежего фекального загрязнения (преимущественно колибактерий), способных ферментировать лактозу до кислоты и газа при 43±0,5°С, в присутствии ингибиторов посторонней микрофлоры. Исследуемый образец воды фильтруют через мембранный фильтр с последующим подращиванием его на среде Эндо в течение 24 ч при 37 о С.

При повторном обнаружении на фильтрах лактозоположительных темно-красных колоний с металлическим блеском и без него параллельно определению коли-индекса эти колонии в количестве не более 15 засевают в лактозную среду с борной кислотой (рец. 143), предварительно нагретую в водяной бане до 43 о С, и 24 ч инкубируют в термостате при 43 С С. Вместо указанной среды можно пользоваться желчно- лактозной средой с бриллиантовым зеленым (рец. 142), инкубацией посевов при 44,5°С.

Помутнение с образованием кислоты и газа в посевах является показателем свежего фекального загрязнения; появление микробного роста (помутнение среды) без газообразования не учитывается.

Определение титра кишечной палочки бродильным методом. Сущность бродильного метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды, инкубации ее при 37°С в средах накопления с последующим высевом на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и определением наиболее вероятного числа бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды по таблицам.

Первый день. Для установления титра кишечной палочки бродильным методом воду в зависимости от характера водоисточника засевают во флаконы и пробирки с глюкозо-пептонной (рец. 140) или лактозо-пептонной средой (рец. 141) с поплавками или комочками ваты для выявления газообразования:

а) при исследовании воды на этапах очистки и обеззараживания засевают: 100; 10; 1, 0,1 мл;

б) на выходе в водопроводную сеть - три объема по100 мл; три объема по 10 мл; три объема по 1 мл.

Посев воды в объеме 100 и 10 мл производится во флаконы и пробирки, соответственно с 10 и 1 мл концентрированной питательной среды. Посев воды в объеме 1 и 0,1 мл засевается в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации. Флаконы и пробирки с засеянными средами инкубируют в термостате 24 ч при 37 С С.

Второй день. 1. Учитывают результаты посевов:

а) отсутствие помутнения и образования кислоты и газа во флаконах и пробирках, является показателем отрицательного результата на наличие бактерий группы кишечной палочки в исследуемом объеме воды, дающим право закончить исследование через 24 ч;

б) при помутнении питательной среды с образованием кислоты и газа или помутнении и кислотообразовании (на глюкозо-пептонной среде) или только помутнении (на лактозо-пептонной среде) производится высев на среду Эндо. Высев делается бактериальной петлей, густым штрихом, для получения изолированных колоний. Чашки с посевами инкубируют 16-18 ч при 37 С С.

Третий день. 1 Просматривают посевы на среде Эндо:

а) отсутствие микробного роста или наличие пленчатых, губчатых колоний с неровной поверхностью и краями, а также плесневых и других не характерных для кишечной палочки колоний является основанием для отрицательного ответа;

б) при обнаружении лактозоположительных темно-красных колоний с металлическим блеском или без него необходимо установить принадлежность выросших микроорганизмов к семейству кишечных бактерий. С этой целью производится микроскопирование материала колоний и постановка оксидазного теста.

2. Оксидазный тест при исследовании воды бродильным методом ставится следующим образом. Со среды Эндо бактериальной петлей или стеклянной палочкой снимают по 2-3 колонии каждого типа. Снятую таким образом микробную массу наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом (рец. 32). При отрицательном результате оксидазного теста бумага в месте нанесения бактериальной культуры цвета не изменяет. При положительном, результате - в течение минуты -приобретает ярко-синюю окраску. При постановке данного теста одним из обязательных условий является исследование изолированных колоний, так как примесь оксидазоположительных бактерий может привести к ложному посинению материала и необоснованному исключению при подсчете колоний кишечных палочек.

Наличие в мазках грамотрицательных неспороносных палочек с отрицательной реакцией оксидазного теста позволяет немедленно дать положительный ответ о наличии бактерий группы кишечной палочки в исследуемой воде.

При исследовании питьевой воды учитывают розовые и бесцветные колонии. В этих случаях из 2-3 колонии разного типа делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При обнаружении грамотрицательных неспороносных палочек с колониями каждого типа ставится оксидазный тест. При наличии грамположительных или спорообразующих бактерий и положительном результате оксидазного теста на 40-42-м часу ведения анализа дается отрицательный результат на наличие бактерий кишечной группы исследуемого объема воды.

3. При выявлении в воде грамотрицательных, бесспоровых, оксидазоотрицательных бактерий из 2-3 колоний различного типа берут микробную культуру для высева в полужидкую среду с глюкозой. Результат роста учитывают после 4-5 ч инкубации в термостате при 37° С:

а) При обнаружении кислоты и газа в посеве дается положительный ответ;

6) при отсутствии кислоты и газа дается отрицательный ответ;

в) при наличии в посевах только кислоты пробирки оставляют еще на 24 ч для окончательного учета. При отсутствии газообразования на 2-е сутки дается окончательный отрицательный результат, при появлении газа - окончательный положительный результат.