Установите последовательность этапов выращивания растений табака из каллусной ткани

Добавил пользователь Евгений Кузнецов
Обновлено: 19.09.2024

Каллусная ткань представляет собой неорганизованную массу делящихся клеток. Индуцированный каллус, как правило, гетерогенен и состоит из разнообразных типов и групп клеток, которые отличаются своими размерами. Каллусные культуры используют у ряда растений с целью получения в культивируемых условиях необходимых биопродуцентов, что осуществляют в промышленных условиях, а при индукции в каллусной ткани проростков - для размножения исходного растения - донора или получения сомаклонов.

Каллусную ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого цвета. Очень редко она может иметь интенсивную зеленую окраску (у мандрагоры) . Темно-коричневая окраска возникает чаще при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от них в питательные среды вносят антиоксиданты.

Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции: 1) рыхлой, состоящей из сильно оводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мелкие агрегаты; 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами; 3) плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.

В результате выхода из-под контроля организма рост каллусных клеток происходит неорганизованно, асинхронно, и является неограниченным. При пересадках на свежую питательную среду культура каллусной ткани моркови, полученная Р. Готре более 60 лет назад, до сих пор растет в коллекции.

Длительное время считали, что каллусные клетки генетически строго однородны. Однако в 60-х годах было выяснено, что клетки каллусной ткани обладают выраженной генетической гетерогенностью.

Для селекционера каллус представляет интерес прежде всего из-за довольно высокой генетической вариабельности его клеток. Установлено, что плоидность каллусных клеток значительно варьирует и особенно при их длительном культивировании. При этом образуются полиплоидные, анеуплоидные и другие генетически измененные клетки.

Цитологический анализ, показал, что в 45-дневном каллусе растений малины сорта Карнавал встречаются клетки с числом хромосом: 7.13,14,15,16, т. е. наблюдается широкое варьирование по числу хромосом. В норме соматические клетки изучаемых растений малины содержат 2п (2х) = 14 хромосом. Следовательно, при регенерации из каллусной ткани могут возникнуть растения, отличающиеся от исходных родительских форм, что будет способствовать увеличению спектра генетической изменчивости для селекции.

Образования каллуса на экспланте в стерильной культуре часто происходит спонтанно. Однако интенсивность формирования каллусной ткани на агаризованной среде можно стимулировать добавлением ряда веществ, относящихся к различным группам ФАВ. Отмечено, что каллусообразованию способствует относительно высокое содержание в среде ауксинов или их сочетание с низкой концентрацией цитокининов.

Культуру каллуса можно получить из различных органов (листьев, побегов, корней) растений разных видов,

Исходный эксплант для получения каллуса представляет собой фрагмент ткани или органа, инкубируемой самостоятельно или используемой для получения первичного каллуса. Для этих целей более пригодны ткани молодых листьев, т. к. образование каллуса происходит интенсивнее.

В биотехнологии каллусом называют недифференцированные клетки, являющиеся тотипотентными и способными поэтому дать начало целому растению. Являются объектом генетической инженерии. В биологии растений каллусом называют также клетки, образующиеся на раневой поверхности растения в виде опробковевающей ткани, которая возникает в результате деления пограничных с раной клеток [1].
Каллусная ткань способствует зарастанию ран, срастанию прививок и т. д.

Воспроизведение организмов, его значение. Способы размножения, сходство и различие полового и бесполого размножения. Оплодотворение у цветковых растений и позвоночных животных. Внешнее и внутреннее оплодотворение .

Онтогенез и присущие ему закономерности. Эмбриональное и постэмбриональное развитие организмов. Причины нарушения развития организмов.

Закономерности изменчивости. Ненаследственная (модификационная) изменчивость . Норма реакции . Наследственная изменчивость: мутационная, комбинативная. Виды мутаций и их причины. Значение изменчивости в жизни организмов и в эволюции .

Селекция , ее задачи и практическое значение. Вклад Н.И. Вавилова в развитие селекции: учение о центрах многообразия и происхождения культурных растений; закон гомологических рядов в наследственной изменчивости. Методы селекции и их генетические основы. Методы выведения новых сортов растений, пород животных, штаммов микроорганизмов. Значение генетики для селекции. Биологические основы выращивания культурных растений и домашних животных.

Биотехнология , ее направления. Клеточная и генная инженерия, клонирование . Роль клеточной теории в становлении и развитии биотехнологии. Значение биотехнологии для развития селекции, сельского хозяйства, микробиологической промышленности, сохранения генофонда планеты. Этические аспекты развития некоторых исследований в биотехнологии (клонирование человека, направленные изменения генома).

Заданий относится к повышенному уровню, за правильное выполнение можно получить 2 балла.

Разбор типовых заданий №8 ЕГЭ по биологии

Воспроизведение организмов/Биотехнология
Закономерности наследственности и изменчивости
Онтогенез. Жизненный цикл растений/ Зародышевые листки

Выглядит сложно, но, если разобраться, то все не так плохо. Можно выделить 20 типов заданий, это не так много, потому что несколько заданий могут относиться к одной теме.

Воспроизведение организмов и Биотехнология

Половое и бесполое размножение

А) происходит без образования гамет

Б) участвует лишь один организм

В) происходит слияние гаплоидных ядер

Г) образуется потомство идентичное исходной особи

Д) у потомства проявляется комбинативная изменчивость

Е) происходит с образованием гамет

Запишите в ответ цифры, расположив их в порядке, соответствующем буквам:

Основная черта полового размножения — участие в процессе гамет (половых клеток) двух разнополых организмов, потомство притом получается разнородным, так как проявляется наследственная изменчивость, а именно — комбинативная.

У бесполого размножения, соответственно, все наоборот: потомство идентичное, участвует одна особь.

А	Б	В	Г	Д	Е
1	1	2	1	2	2

Установите соответствие между способом размножения и конкретным примером: к каждой позиции, данной в первом столбце, подберите соответствующую позицию из второго столбца.

А) спорообразование папоротника

Б) образование гамет хламидомонады

В) образование спор у сфагнума

Г) почкование дрожжей

Запишите в ответ цифры, расположив их в порядке, соответствующем буквам:

Читаем дальше. Нерест рыбы. Это просто. Ну, конечно же, это половое размножение.

Почкование — однозначно бесполое. Очень известный пример данного типа размножения, поэтому вряд ли вызовет вопросы.

И у мха, и у папоротника есть зиготы. В ответах этого слова нет, так что относится к половому размножению эти варианты не могут.

А	Б	В	Г	Д
1	2	1	1	2

Гаметогенез

Установите соответствие между процессом, происходящим при сперматогенезе, и зоной, в которой происходит данный процесс.

А) митотическое деление первичных половых клеток

Б) образование диплоидных сперматогониев

В) образование сперматоцитов 1-го порядка

Г) мейотическое деление клеток

Д) образование гаплоидных сперматид

2) зона размножения

3) зона созревания

Запишите в ответ цифры, расположив их в порядке, соответствующем буквам:

Гаметогенез -процесс развития и созревания половых клеток: сперматозоидов и яйцеклеток.

На каждой стадии у клеток есть свои названия:

Клетки, получившиеся в результате митозов называются сперматогонии и овогонии.

Клетки, которые делятся первый раз мейозом- сперматоцит и овоциты I порядка.

Второй раз мейоз — сперматоциты и овоциты II порядка.

После второго мейоза сперматоциты становятся сперматидами, а потом- сперматозоидами.

После второго мейоза 3 клетки отмирают, а одна становится яйцеклеткой.

Рассмотрим еще одну схему. Стадия размножения охватывает многократное деление митозом первичных половых клеток.

Увеличение размеров клеток и первый мейоз- стадия роста.

Второй мейоз и до конца – созревание.

Соединим данные с названиями клеток, стадиями и делениями:

А	Б	В	Г	Д
2	2	1	3	3

Типы развития насекомых

Прямое – ребенок похож на родителя, только меньше по размерам и у него недоразвиты некоторые органы (млекопитающие, птицы).
Непрямое (с превращением, с метаморфозом) – ребенок (личинка) сильно отличается от родителя (лягушки, насекомые).

При непрямом развитии уменьшена конкуренция между детьми и взрослыми, поскольку они живут в разных местах и питаются разной пищей.

У всех насекомых развитие непрямое, превращение может быть полное и неполное.

Полное: из яйца развивается личинка, она питается, растет, затем превращается в покоящуюся стадию куколку, внутри которой происходит полная перестройка всех органов, из куколки выходит взрослое насекомое ( имаго ).

Неполное: стадия куколки отсутствует.

Установите соответствие между насекомым и типом его развития: к каждой позиции, данной в первом столбце, подберите соответствующую позицию из второго столбца.

А) медоносная пчела

В) азиатская саранча

Г) капустная белянка

Д) зеленый кузнечик

1) с неполным превращением

2) с полным превращением

Запишите в ответ цифры, расположив их в порядке, соответствующем буквам:

Для выполнения этого задания нужно не только выучить что такое полное\неполное превращение, но и отряды насекомых (или как минимум по представителю).

А	Б	В	Г	Д
2	2	1	2	1

Различные методы

Установите соответствие между методом селекции и его использованием в селекции растений и животных.

А) массовый отбор

Б) отбор по экстерьеру

В) получение полиплоидов

Г) искусственный мутагенез

Д) испытание родителей по потомству

1) селекция растений

2) селекция животных

Запишите в ответ цифры, расположив их в порядке, соответствующем буквам:

Массовый отбор, наверно, больше характерен для растений нежели, для животных. Растений просто больше и они занимают большие площади территории.

Экстерьер — внешний вид . Это относится к селекции животных. Выведение новых пород основано и на этом тоже, на внешнем виде.

Полиплоидов скорее легче получить у растений, чем у животных. Они проще.

Животных не подвергают искусственному мутагенезу из-за смертности.

Родители, потомство — явно говорится о животных.

А	Б	В	Г	Д
1	2	1	1	2

Установите соответствие между методами и областями науки и производства, в которых эти методы используются: к каждой позиции, данной в первом столбце, подберите соответствующую позицию из второго столбца.

А) получение полиплоидов

Б) метод культуры клеток и тканей

В) использование дрожжей для производства

белков и витаминов

Г) метод рекомбинантных плазмид

Д) испытание по потомству

Запишите в таблицу выбранные цифры под соответствующими буквами.

Разберемся с терминологией:

Биотехнология — это производство необходимых человеку продуктов и материалов с помощью живых организмов, культивируемых клеток и биологических процессов.

Селекция: получение полиплоидов; испытание по потомству; гетерозис. Биотехнология: метод культуры клеток и тканей; использование дрожжей для производства белков и витаминов; метод рекомбинантных плазмид.

Гетерозис — увеличение жизнеспособности гибридов вследствие унаследования определённого набора аллелей различных генов от своих разнородных родителей.

По простому, если обобщить, то в биотехнологии из одного генерируют другое, а при селекции используют существующие материалы и работают с ними.

А	Б	В	Г	Д	Е
1	2	2	2	1	1

Установите соответствие между приёмами и методами биотехнологии: для этого к каждому элементу первого столбца подберите соответствующий элемент из второго столбца.

А) работа с каллусной тканью

Б) введение плазмид в бактериальные

В) гибридизация соматических клеток

Г) трансплантация ядер клеток

Д) получение рекомбинантной ДНК и РНК

1) клеточная инженерия

2) генная инженерия

Запишите в таблицу выбранные цифры под соответствующими буквами:

Здесь все совсем легко: где клетка — там клеточная инженерия, где не клетка- генная. Ну и ткань состоит из клеток.

А	Б	В	Г	Д
1	2	1	1	2

Закономерности наследственности и изменчивости

Наследственность — способность организмов передавать свои признаки и особенности развития потомству. Благодаря этой способности все живые существа сохраняют в своих потомках характерные черты вида.

Изменчивость — разнообразие признаков среди представителей данного вида, а также свойство потомков приобретать отличия от родительских форм

Генная мутация — изменения ДНК в пределах одного гена.

Геномная мутация— мутация, в результате которой происходит изменение числа хромосом .

Гаплоидия— уменьшение в кариотипе соматических клеток числа хромосом вдвое.
Полиплоидия — увеличение в кариотипе соматических клеток числа хромосом в какое-то количество раз.
Анеуплоидия— изменение в кариотипе соматических клеток числа хромосом на какое-то число.
Полисомия— появление в генотипе дополнительных половых хромосом (X,Y).

Хромосомные мутации— изменения в структуре хромосом.

Делеция — утрата участка хромосомы.
Дупликация — удвоение участка хромосомы.
Инверсия — поворот на 180 градусов участка хромосомы

Транслокация — перестановка участка хромосомы на другое место.

Мутации

Установите соответствие между характеристикой мутации и ее типом.

А) включение двух лишних нуклеотидов в молекулу ДНК

Б) кратное увеличение числа хромосом в гаплоидной клетке

В) нарушение последовательности аминокислот в молекуле белка

Г) поворот участка хромосомы на 180 градусов

Д) уменьшение числа хромосом в соматической клетке

Е) обмен участками негомологичных хромосом

Запишите в таблицу выбранные цифры под соответствующими буквами.

2.кратное увеличение числа хромосом-геномная

3.аминокислоты, состоящие из триплетов нуклеотидов- генная

4.поворот хромосомы- хромосомная

5.уменьшение числа хромосом- геномная

6.обмен участками хромосом- хромосомная

А	Б	В	Г	Д	Е
2	3	2	1	3	1

Установите соответствие между характеристикой изменчивости и её примерами: к каждой позиции, данной в первом столбце, подберите соответствующую позицию к рисунку из второго столбца.

А) изменчивость носит групповой характер

Б) приводит к созданию новых генотипов

Г) проявляется в новых комбинациях признаков

Д) изменения носят только фенотипический характер

Е) изменения определяются нормой реакции

Запишите в ответ цифры, расположив их в порядке, соответствующем буквам:

Если у растения листья вытянулись из-за недостатка света, но растение изменилось только внешне, то есть фенотипически. В генотипе у него ничего не изменилось. Это был пример ненаследственной изменчивости, она же фенотипическая, она же модификационная.

Модификационная изменчивость носит групповой характер, а комбинативная- индивидуальный.

А	Б	В	Г	Д	Е
1	2	2	2	1	1

Норма реакции

Установите соответствие между признаком и диапазоном его нормы реакции : к каждой позиции, данной в первом столбце, подберите соответствующую позицию из второго столбца.

А) строение глаза насекомого

Б) удойность коровы

В) урожайность пшеницы

Г) масса тела человека

Д) количество пальцев на руках

1) узкая норма реакции

2) широкая норма реакции

Запишите в ответ цифры, расположив их в порядке, соответствующем буквам

Норма реакции — это та максимальная доля от фенотипического значения признака, на которую может изменить признак среда.

Глаз одного вида насекомых не будет кардинально отличаться, норма реакции узкая.

Корова может дать в один день много молока, а в другой- всего ничего, норма широкая.

Один год может быть урожайным, а другой — нет, норма широкая.

Человек весил 55 кг, набрал до 100кг, норма широкая.

Количество пальцев в норме 5, бывают аномалии, но +-1, норма узкая.

А	Б	В	Г	Д
1	2	2	2	1

Онтогенез. Жизненный цикл растений и зародышевые листки.

Стадии развития

Каждый зародышевый листок дает начало чему-то

Зародышевый листок	Системы органов
Эктодерма	Кожа, нервная система, органы чувств
Мезодерма	Пищеварительный канал, печень, поджелудочная железа, легкие, хорда
Энтодерма	Мышцы, кровь , сосуды, кости, хрящи, гонады

Установите соответствие между процессами, происходящими на разных стадиях развития зародыша трёхслойных животных, и стадиями, на которых эти процессы происходят: к каждой позиции, данной в первом столбце, подберите соответствующую позицию из второго столбца.

А) образуется однослойный зародыш

Б) формируется мезодерма

В) образуется двуслойный зародыш

Г) образуется вторичная полость тела

Д) образуется однослойный зародышевый пузырёк

Е) начинается органогенез

Запишите в таблицу выбранные цифры под соответствующими буквами

Однослойный зародыш — это бластуляция.

Образование мезодермы происходит в стадию нейрулы.

Двуслойный зародыш — гаструляция.

Вторичная полость — нейрула.

Первичный пузырек — бластула.

А	Б	В	Г	Д	Е
1	3	2	3	1	3

Жизненный цикл мха

Жизненные циклы остается только выучить.

На схеме видно, что взрослые растения гаплоидны, а это значит, что гаплоидны и листья.

Объектам исследования клеточной биотехнологии растений является клеточная культура.

Культуры клеток высших растений имеют две сферы применения: 1.Изучение биологии клетки, существующей вне организма, обуславливает ведущую роль клеточных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитологии растений. Популяциям растительных клеток присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференцированной активности генов) и физиологические. При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции идет размножение клеток, фенотип и генотип которых соответствуют данным условиям выращивания, следовательно, популяция эволюционирует. Все это позволяет считать, что культуры клеток являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока мало изучены. Культуры клеток и тканей могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения.

2. Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.

Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:

1. Получение биологически активных веществ растительного происхождения.

2. Ускоренное клональноемикроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3. Получение безвирусных растений.

4. Эмбриокультура и оплодотворение invitro часто применяются для преодоления постгамной несовместимости или щуплости зародыша, для получения растений после отдаленной гибридизации

5. Антерные культуры – культуры пыльников и пыльцы используются для получения гаплоидов и дигаплоидов.

6. . Клеточный мутагенез и селекция. Криоконсервация и другие методы сохранения генофонда.

7. Иммобилизация растительных клеток.

8. Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.

9. .Конструирование клеток путем введения различных клеточных оганелл.

10. .Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.

Некоторые аспекты в регуляции морфогенеза: дифференциация клеток, тотипотентность, компетентность и детерминация клеток

При культивировании тканей растений на таких средах многие клетки оказываются способными к неограниченному размножению, образуя слои (массу) недифференцированных клеток, получивших названиекаллуса. Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей различных органов высших растений - корней, листьев, стеблей, пыльников, зародышей (экспланты) помещают на искусственную среду, содержащую ауксины, в пробирки, колбы, чашки Петри (invitro).

Каллус – группа дедифференцированных клеток, возникших invivoилиinvitroпутем неорганизованной пролиферации. Культура каллусов invitro– выращивание в длительности.

Дедифференциация – переход специализированных клеток к пролифирации и неорганизованному каллусному росту (утрата клетками специализации).

Редифференциация – переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими делениями или непосредственно. Дифференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между клетками. Дифференцировка – состояние специализации клеток, отличающее их от других

Процессу образования каллуса предшествует дедифференцировка тканей экспланта. При дедифференцировке ткани теряют структуру, характерную для их специфических функций в растении, и возвращаются к состоянию делящихся клеток.

Клетки в культуре могут существовать в двух видах: в виде суспензии в жидкой питательной среде и на поверхности твердой питательной среды в виде каллуса.

3. Культура растительных клеток как объект генетической трансформации.

Трансгенным (или генетически модифицированным) называется растение, в геном которого методами генетической инженерии перенесены гены (их называют "трансгенами") из других организмов. Процесс переноса называется генетической трансформацией. Основными преимуществами такой технологии по сравнению с традиционной селекцией являются: возможность переноса всего одного гена, что практически не затрагивает исходный генотип; возможность придания признаков, которые нельзя перенести путем скрещивания с близкородственными видами; значительное ускорение процесса получения новых генотипов. Наиболее широко используемый метод трансформации - агробактериальный был разработан на основе природного процесса. Почвенная бактерия Agrobacteriumtumefaciens способна инфицировать двудольные растения, вызывая опухоли - корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, ненужные растению, но используемые в пищу бактериями. Ученые модифицировали агробактерии таким образом, что они вместо собственных переносят в растения гены, нужные человеку. Впоследствии был разработан ряд других методов трансформации растительных клеток, из которых наибольшее распространение приобрел биобаллистический. Он используется чаще всего для генетической модификации однодольных растений, нечувствительных к агробактериям. В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них ДНК ускоряют при помощи сжатого гелия, и они проникают в ДНК клеток мишени.

Билет 4

Индукция каллуса. Морфогенез в культуре тканей растений.

Существует несколько путей, по которым может пойти каллусная клетка после ее дедифференцировки: 1) вторичная регенерация целого растения, возможна дифференцировка на уровне клеток, тканей, органов; 2) утрата способности к вторичной дифференцировке и регенерации растений, стойкая дедифференцировка, приобретение способности расти без гормонов - опухолевая (это явление чаще наблюдается у старых культур); 3) нормальный онтогенез каллусной клетки, заканчивающийся ее старением и умиранием. Клетка претерпевает вторичную дифференцировку и прекращает делиться (стационарная фаза). Интереснее регенерация. В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток. Существуют различные типы морфогенеза: органогенез - корневой, стеблевой, флоральный, листовой; соматический эмбриогенез (образование зародышеподобных структур из соматических клеток). В случае органогенеза сначала регенерируют отдельные органы, а затем уже из них - целые растения, исключение - корневой органогенез . В отличие от органогенеза при соматическом эмбриогенезе сразу образуется биполярная структура (соматический зародыш), имеющая зачаточный корешок и стеблевую почку, из которой развивается растение.

Тотипотентность - это способность любой клетки воспроизвести целое растение. Любая растительная клетка содержит весь набор генов и сохраняет свойственную зиготе программу развития любого органа: лист, лепесток, сердцевинная паренхима и т.п. Однако возможности разных типов клеток различны, свойство тотипотентности не всегда реализуется. В некоторых клетках гены в сильной степени репрессированы. В организме тотипотентность не проявляется, так как организм подавляет потенциал развития отдельной клетки, изоляция способствует проявлению этих потенций. Клеточную основу морфогенеза составляет цитодифференцировка. Регенерация растений начинается с вторичнойдедифференцировки. При этом дедифференцированные клетки вновь приобретают структуру и функции специализированных. Большая роль в этом процессе принадлежит фитогормонам. Они вызывают изменение метаболизма клеток. Вторичная дифференцировка каллусных клеток не всегда заканчивается морфогенезоим и регенерацией растений. Иногда это гистодифференцировка. Таким путем клетка каллуса может превращаться во флоэмные и ксилемные элементы, из активной клетки в старую. Для управления морфогенезом используются внешние и внутренние факторы: внутренние - вид растения, генотип, орган, из которого взят эксплант; внешние - состав питательной среды, температура, свет (интенсивность, спектр, длина фотопериода).

Сигналом (импульсом) морфогенеза является изменение соотношения цитокининов и ауксинов, т.е. они не только регуляторы роста, но и дифференцировки. Эмбриогенез фактически не зависит от гормонов. Обычно эмбриогенные зоны возникают в каллусной ткани на той же питательной среде, на которой шло каллусообразование. Развитие соматических зародышей в каллус-ной ткани начинается тогда, когда устраняется дедифференцирующий фактор из питательной среды. Развивающийся зародыш не нуждается в экзогенных гормонах. Дополнительные стимулы морфогенеза - азотнокислое серебро, нитрат аммония, некоторые аминокислоты (пролин, тирозин, иногда серин), полиамины (путресцин и спермидин). В ряде случаев стимулируют морфогенез маннит и сорбит. Ионы окиси азота влияют на развитие возникающих в каллусной ткани организованных структур, а их индукцию стимулируют ионы аммония - NH4. Гибберелловая кислота способствует росту зачатков стебля, а абсцизовая - ускоряет дифференциацию органов соматических зародышей. Азотнокислое серебро продлевает регенерационную способность в старых пересадочных культурах. Лишь одна из 400-1 000 клеток регенерирует. Одного стимула недостаточно, необходима еще готовность к нему. Способность воспринимать стимулы морфогенеза определяется как компетентность клетки.

2. Получение соматических гибридов методом слияния изолированных протопластов. Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще в конце прошлого века. Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как в 1960 г. И. К. Коккинг впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты. В настоящее время продолжается разработка и совершенствование методов выделения и культивирования протопластов на искусственных питательных средах. Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаС12. В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На формирование колоний протопластами влияет состав питательной среды. Дальнейшая задача – получение из каллусной ткани растений-реге-нерантов. Пока не удалось получить регенеранты из протопластов многих злаковых (пшеницы, ячменя). Однако успешно осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты) и других культур. Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и целлюлозой. Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но довольно редко. Индуцированное слияние изолированных протопластов впервые было получено в лаборатории Коккинга в 1970 г. его сотрудниками Пауэром и др. В качестве индуктора они использовали нитрат натрия. Но этот метод оказался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким рН (9–11) и высокой концентрацией ионов кальция (100–300 мМ). Протопласты предварительно агглютинируют с помощью концентрированных растворов полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500–6000. У. Циммерман с сотрудниками.разработали физический метод слияния протопластов животных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использовались импульсы электрического тока. Слияние протопластов приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного. Это возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер, и одно ядро дегенерирует. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облучения. Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несущие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам. Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotianaglauca и N. Langsdorfii. В настоящее время методом парасексуальной гибридизации получено большое число межвидовых, межсемейственных и межтрибных гибридов. Однако во многих случаях гибридные растения, полученные таким путем, в той или иной степени ненормальны. Примером может служить соматический гибрид между арабидопсисом и турнепсом, который является растением- монстром. Возникающие аномалии являются результатом хромосомной несбалансированности. Особый интерес представляют межцарственные клеточные гибриды, полученные от слияния протопластов растительных и животных клеток. Описаны гибриды между протопластами эритроцитов крысы и протопластами дрожжевых клеток, между протопластами моркови и человека, табака и человека и др. При соматической гибридизации эксперимент строится аналогично опытам по генетике микроорганизмов. Иными словами, используются большие популяции клеток обоих родителей. При обработке смешанной суспензии протопластов фьюзогенами часть из них сливается друг с другом, но в суспензии остаются и неслившиеся протопласты. Все они, включая гибридные, вдальнейшем регенерируют клеточные стенки и переходят к делениям. Возникает задача – выделить из общей массы гибридные экземпляры. Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими методами. Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селективных маркеров использовались зеленые хлоропласты табака и красно-оранжевые хромопласты моркови. Другим методом, позволяющим производить отбор гибридов, является генетическаякомплементация. Этот метод был применен для обнаружения гибридов табака, при этом использовались хлорофиллдефектные мутации у родителей с последующей комплементацией в гибридных продуктах. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светоза-висимуюхлорофилльную недостаточность. Растения, гомозиготные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. После слияния и регенерации клеточные колонии пересаживают на среду, индуцирующую стеблевой органогенез, и культивируют на свету. Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразумевают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия. Например, половые гибриды между N. glauca и N. Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов в условиях invitro способны расти и размножаться на питательных средах без гормонов. Гормононезависимость клеток гибрида и была положена в основу метода селекции. После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти в этих условиях. Существуют также другие методы селекции соматических гибридов: смешанная физиологогенетическаякомплементация, физическое обогащение (метод основан на разделении протопластов при центрифугировании в связи с их различной плотностью), механическая изоляция. Использование изолированных протопластов в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоропласты. Из этих протопластов Карлсон получил растения-регенеранты, содержащие хлоропласты другого организма. Однако работы по переносу чужеродных органелл и ДНК только начинают развиваться. В целом использование изолированных протопластов в генетической реконструкции клетки, как мы видим, открывает богатые перспективы перед клеточной селекцией

19. Культуры соматических клеток растений. Этапы каллусогенеза. Методы культивирования клеток и тканей растений

В основе культивирования растительных клеток лежит свойство тотипотентности, благодаря которому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть обеспечить развитие всего растения. Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования.

Изменяя условия (добавляя в состав питательной среды те или иные гормоны), можно вызвать дифференциацию недетерминированных клеток. Культура растительной ткани позволяет получить многочисленные популяции в сравнительно короткое время и в ограниченном пространстве. Клетки в условиях in vitro лишаются очень многих важных взаимодействий, которые определяют их судьбу и дифференциацию в целом организме. В определенных пределах дифференциация культивируемых клеток поддается контролю со стороны экспериментатора.

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус. Каллусная ткань - один из видов клеточной дифференцировки, возникает путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток органов растения. У растений в природе каллусная ткань возникает в исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует непродолжительное время. Эта ткань защищает место поражения, может накапливать питательные вещества для анатомической регенерации или регенерации утраченного органа.

Основные этапы получения каллусных культур

Выбор экспланта.

Двудольные травянистые.
Однодольные травянистые.
Зерновые культуры.
Голосемянные.

Каллусы двудольных растений могут быть легко получены из:

отрезков стебля и корней;
изолированных фрагментов паренхимы тканей клубня;
сердцевины стебля;
мезофилла листа;
органов цветка (завязи, пыльцы)

Каллусы однодольных растений обычно получают из:

зародышей;
отрезков основания стебля;
корней.

Подбор питательной среды, условий культивирования.

Стерилизация растительного материала:

престерилизация,
стерилизация,
постстерилизация.

Изоляция эксплантов (минимальный критический размер экспланта). Перенос стерильных эксплантов на питательную среду.

Герметизация

Культивирование:

наращивание первичного каллуса;
субкультивирование – перенос трансплантана свежую питательную среду. В оптимальных условиях осуществляется через 3-4 недели.

Отбор каллуса:

для решения фундаментальных проблем биологии;
для биотехнологических целей.

Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro можно разделить на 2 группы:

вспомогательные технологии,
вторая группа методов.

Она ведет к самому, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений. Оплодотворение in vitro (преодоление программной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение м/у выбранными парами в естественных условиях. Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами:

культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой;
завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи котоҏыҳ или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца.

Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш не ᴨпереходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению.

Преодоление постгамной несовместимости. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосᴨерма.

Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Эмбриокультура дает возможность вырастить гибридные растения из неполноценных зародышей. Однако выход гибридных растений мал, и гибриды часто бывают стерильны.

Получение гаплоидов in vitro и использование их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций.

Криосохранение растений. Криосохранение соматических клеток растений в жидком азоте (темᴨература - 196° С) - новое направление в биотехнологии, которое широко стало развиваться с начала 70-х годов XX столетия. Цель данной технологии заключается в сохранении в культуре in vitro генофонда.

Клеточная селекция растений: сомаклональная вариабельность. Метод культуры изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro, широко используемый для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений, сегодня находит все большее применение и при создании новых биотехнологий Клеточные изменения могут происходить в изолированных клетках, растущих на искусственных питательных средах, и причины, их вызывающие. С разработкой техники получения растений-регенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений.

Селекция растений на клеточном уровне. Значительный интерес представляет вопрос об использовании клеточной селекции в комплексе с получением сомаклонов. Одна из наиболее сильных сторон культуры in vitro в создании технологий для с/х – возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мутаций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками.

Читайте также: