Улучшение растений и животных на основе клеточных технологий

Добавил пользователь Алексей Ф.
Обновлено: 19.09.2024

Традиционная селекция микроорганизмов (в основном бактерий и грибов) основана на экспериментальном мутагенезе и отборе наиболее продуктивных штаммов. Но и здесь есть свои особенности. Геном бактерий гаплоидный, любые мутации проявляются уже в первом поколении. Хотя вероятность естественного возникновения мутации у микроорганизмов такая же, как и у всех других организмов (1 мутация на 1 млн. особей по каждому гену), очень высокая интенсивность размножения дает возможность найти полезную мутацию по интересующему исследователя гену.

В результате искусственного мутагенеза и отбора была повышена продуктивность штаммов гриба пеницилла более чем в 1000 раз. Продукты микробиологической промышленности используются в хлебопечении, пивоварении, виноделии, приготовлении многих молочных продуктов. С помощью микробиологической промышленности получают антибиотики, аминокислоты, белки, гормоны, различные ферменты, витамины и многое другое.

Микроорганизмы используют для биологической очистки сточных вод, улучшений качеств почвы. В настоящее время разработаны методы получения марганца, меди, хрома при разработке отвалов старых рудников с помощью бактерий, где обычные методы добычи экономически невыгодны.

Биотехнология — использование живых организмов и их биологических процессов в производстве необходимых человеку веществ. Объектами биотехнологии являются бактерии, грибы, клетки растительных и животных тканей. Их выращивают на питательных средах в специальных биореакторах.

Новейшими методами селекции микроорганизмов, растений и животных являются клеточная, хромосомная и генная инженерия.

Генная инженерия

Процесс создания трансформированных бактерий включает в себя следующие этапы.

Образование рекомбинантных плазмид:
1 — клетка с исходной плазмидой; 2 — выделенная плазмида; 3 — создание вектора; 4 — рекомбинантная плазмида (вектор); 5 — клетка с рекомбинантной плазмидой.

Эукариотические гены, в отличие от прокариотических, имеют мозаичное строение (экзоны, интроны). В бактериальных клетках отсутствует процессинг, а трансляция во времени и пространстве не отделена от транскрипции. В связи с этим для пересадки эффективнее использовать искусственно синтезированные гены. Матрицей для такого синтеза является иРНК. С помощью фермента обратная транскриптаза на этой иРНК сперва синтезируется цепь ДНК. Затем на ней с помощью ДНК-полимеразы достраивается вторая цепь.

Хромосомная инженерия

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия — конструирование клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции.

Клетки растений и животных, помещенные в питательные среды, содержащие все необходимые для жизнедеятельности вещества, способны делиться, образуя клеточные культуры. Клетки растений обладают еще и свойством тотипотентности, то есть при определенных условиях они способны сформировать полноценное растение. Следовательно, можно размножать растения в пробирках, помещая клетки в определенные питательные среды. Это особенно актуально в отношении редких или ценных растений.

С помощью клеточных культур можно получать ценные биологически активные вещества (культура клеток женьшеня). Получение и изучение гибридных клеток позволяет решить многие вопросы теоретической биологии (механизмы клеточной дифференцировки, клеточного размножения и др.). Клетки, полученные в результате слияния протопластов соматических клеток, относящихся к разным видам (картофеля и томата, яблони и вишни и др.), являются основой для создания новых форм растений. В биотехнологии для получения моноклональных антител используются гибридомы — гибрид лимфоцитов с раковыми клетками. Гибридомы нарабатывают антитела, как лимфоциты, и обладают возможностью неограниченного размножения в культуре, как раковые клетки.

Метод пересадки ядер соматических клеток в яйцеклетки позволяет получить генетическую копию животного, то есть делает возможным клонирование животных. В настоящее время получены клонированные лягушки, получены первые результаты клонирования млекопитающих.

Метод слияния эмбрионов на ранних стадиях делает возможным создание химерных животных. Таким способом были получены химерные мыши (слияние эмбрионов белых и черных мышей), химерное животное овца-коза.

Особое направление применения клеточных культур и клеточных технологий - тканевая инженерия, связанная с разработкой биоискусственных органов и тканей. В настоящее время на базе накопленных фундаментальных знаний освоены, включая промышленные масштабы, технологии ведения клеточных культур различного происхождения (растительных клеток, клеток насекомых и млекопитающих).

Растительные клетки и культура растительных тканей позволяют регенерировать целое растение из протопластов и клеток. Особенностью клеточных культур растений является их способность к тотипотенции, т.е. в определенной среде и определенных условиях можно регенерировать целое растение из одной клетки. Эта техника обеспечивает за сравнительно короткий срок получение в контролируемых условиях многочисленных популяций клеток и дает возможность идентифицировать линии растений с повышенной биологической продуктивностью.

Клеточная инженерия растений базируется на использовании культуры изолированных клеток, тканей, протопластов. Существует несколько направлений использования этих технологий в растениеводстве.

Первое связано со способностью изолированных растительных клеток продуцировать в культуре ценные биологически активные соединения, в том числе женьшеня или идиолитов, эфирных масел, алкалоидов, глюкозидов и др.

Второе направление - это использование культуры изолированных тканей для клонального размножения растений и оздоровления посадочного материала.

Третье направление - это применение изолированных клеток в селекции растений. Культивируемые на искусственных средах растительные клетки характеризуются большой неоднородностью; при этом возможен отбор клеток, устойчивых к тем или иным неблагоприятным факторам - засухе, низкой температуре, фитопатогенам и пр.

Культуры растительных клеток используют для биотрансформации химических соединений и для эффективного синтеза биологически активных соединений de novo. В культуре клеток сохраняется способность продуцировать биологически активные соединения, свойственные исходному целому растению, что позволяет организовать условия, обеспечивающие синтез ценных продуктов, ранее не обнаруженных в исходных интактных растениях. Например, в культурах растительных клеток стало возможным получать такие ценные соединения, как перицин, перикалин, хинокиол, ферригинол, акуаммалин и др.

Реализованы крупномасштабные культивационные системы растительных клеток для получения различных ценных веществ - ментола, женьшеня, убихинона-10, бетанина, камптотецина (антиканцероген), полипептидов - ингибиторов фитовирусов, агар-агара и др. Например, эффективный и дорогостоящий цитостатический препарат паклитаксель, традиционно получаемый из коры Тиса среднеземноморского (8 т исходного сырья обеспечивают получение 1 кг препарата), в настоящее время с большей эффективностью получают в культуре клеток.

Еще более эффективными оказались процессы с использованием иммобилизованных растительных клеток. Такие биологические системы более устойчивы к механическим повреждениям, при этом фаза роста клеток совпадает с фазой образования продукта; клетки легко переносятся в новую среду или иные культивационные условия. После установления способности апикальной меристемы (небольшой участок недифференцированных клеток на кончике стебля) к росту с образованием целого растения, эта техника стала применяться для клонирования линий растений.

Культура растительных тканей, аналогично культуре клеток, позволяет достаточно быстро получать здоровые растительные клоны и на этой основе - перспективный посадочный материал практически в неограниченных масштабах.

Культуры клеток насекомых дают возможность получать биологические агенты новых типов для борьбы с насекомыми-вредителями без негативного влияния на жизнеспособность полезных видов насекомых, а также не накапливающихся в окружающей среде. Достоинства биологических методов борьбы с вредителями известны уже давно, это бактериальные, грибные и вирусные препараты, получение которых требует специализированной техники и условий. Особенно это характерно для препаратов вирусной группы, производство которых основано на массовом размножении насекомого-хозяина на искусственных средах. Вследствие достаточной трудоемкости производства эти препараты до недавнего времени не находили массового применения.

Новые методы биотехнологии могут повлиять на цену вирусных препаратов. Кроме того, так же как и растительные клетки, клетки насекомых могут быть использованы для синтеза лекарственных препаратов. Начата реализация использования потенциала клеток насекомых для производства VLP-вакцин (VLP - virus-like particle - вирусоподобные частицы), предназначенных для лечения инфекционных заболеваний, таких как атипичная пневмония и грипп. Эта методика могла бы сильно снизить затраты и исключить проблемы безопасности, связанные с традиционным методом, использующим куриные яйца.

Культуры клеток животных широко используют в качестве тест-объектов для оценки безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов. Кроме этого, клетки млекопитающих пригодны для синтеза лекарственных веществ, особенно некоторых животных белков, слишком сложных для того, чтобы синтезировать их с помощью генетически модифицированных микроорганизмов, а также моноклональных антител и вакцин.

Например, компанией Sanofi Pasteur (США) по заказу Министерства здравоохранения и социальных услуг США разрабатываются методы культивирования клеток млекопитающих с целью эффективного синтеза вакцин против гриппа. Особое направление применения клеточных культу, в особенности стволовых клеток, и технологий - терапия и реконструктивная хирургия поврежденных органов и тканей.

Перечень болезней, лечение которых становится возможным благодаря использованию клеточной терапии и трансплантологии, быстро пополняется. Наиболее продвинутым в настоящее время является применение клеточных технологий в кардиологии для лечения инфаркта миокарда, восстановления кровотока в ишемизированных органах и тканях, повышения насосной функции сердца, а также лечения дислипидемий и атеросклероза. В неврологии трансплантационные клеточные технологии начали применять для лечения болезни Паркинсона и болезни Хагинтона.

Имеются примеры положительного использования стволовых клеток костного мозга для заживления ожоговых и глубоких кожных ран, лечения системных и местных костных дефектов. В связи с выявленной противоопухолевой активностью низкодифференцированных кроветворных клеток и их способностью прямо супрессировать опухолевый рост проводятся исследования, направленные на клиническое применение стволовых клеток в онкологии.

Основой для развития новейших реконструктивных технологий являются функционирующие клетки, способные в зависимости от микроокружения формировать ткани разных типов.

Список болезней, при лечении которых клеточные технологии уже используются или их применение планируется в ближайшем будущем, быстро растет. В этот список, по-видимому, войдут все болезни, медикаментозное лечение которых малоэффективно. Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен в первую очередь на создание новых биокомпозиционных материалов для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом.

Основные принципы данного подхода заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биодеградирующихся материалов, которые используют в сочетании с донорскими клетками и/или с биоактивными веществами.

Революционные преобразования традиционных биотехнологических процессов связаны с применением методов генетической инженерии. Метод рекомбинантных ДНК является краеугольным камнем новейшей биотехнологии. Создание рекомбинантных ДНК означает объединение (рекомбинирование) двух отрезков ДНК разных видов.

С помощью генетической инженерии разработаны и используются различные социально значимые технологии и процессы:
- производство новых лекарственных препаратов и безопасных вакцин;
- лечение некоторых генетических заболеваний;
- создание биоконтролирующих агентов для сельского хозяйства;
- повышение урожайности и снижение стоимости продукции;
- снижение аллергенности некоторых продуктов;
- улучшение питательных свойств продуктов;
- разработка биодеградирующих пластмасс;
- снижение уровня загрязненности воды и воздуха;
- замедление скорости порчи пищевых продуктов;
- контроль над вирусными заболеваниями.

Молекулярное, или генетическое, клонирование - процесс создания генетически идентичных молекул ДНК - является основой молекулярной биологии, фундаментальным методом биотехнологических исследований, а также основой развития и коммерциализации биотехнологии. Подавляющее большинство практических приложений биотехнологии, начиная с разработки лекарственных препаратов и заканчивая созданием трансгенных культур, основывается на методах генетического клонирования.

С помощью молекулярного клонирования стали возможными: идентификация, локализация и описание генов; создание генетических карт и секвенирование целых геномов; проведение параллелей между генами и ассоциированными с ними признаками; установление молекулярной основы проявления признаков. Область применения клонирования чрезвычайно широка.

К числу перспективных направлений биотехнологии относится модификация генома культурных растений с целью повышения урожайности и улучшения их устойчивости к вредителям и неблагоприятным условиям среды. Наибольший интерес вызывает, естественно, возможность трансформации однодольных растений (прежде всего, злаковых).

Трансформация генома высших растений реализуется двумя методами: баллистическим и с использованием природной системы переноса генетического материала - части Ti-плазмиды (Т-ДНК) - Agrobacterium tumefaciens -возбудителя бактериального рака или корончатого галла у двудольных растений. В качестве маркерной системы используют гены антибиотикоустойчивости, а также новые системы - Lux-гены или ген бактериальной Р-глюкуронидазы, вызывающий окрашивание селективной среды. Ti-плазмиды, модифицированные разными генами, переносят в растения. Перенос генетической информации с помощью Ti-плазмиды осуществлен и на примере однодольных растений: использовали ткани луковицы гладиолуса с удаленными боковыми частями.

С помощью генетического конструирования стало возможным получение соле-, гербецидо- и морозоустойчивых растений. По оценкам специалистов, в США ежегодный ущерб от заморозков оценивается в 6 млрд дол. Оказалось, что наиболее активными центрами кристаллизации являются отдельные бактерии (представители Pseudomonas, Erwinia), способные вызывать образование льда при 0 оС; их назвали INA-бактерии - активные кристаллизаторы воды (Ice-nucleation Active). В этих бактериях идентифицирован специфический мембранный белок, вызывающий кристаллизацию; ice-гены были клонированы и модифицированы.

Удаление средней части привело к потери способности экскретировать белок кристаллизации. В результате бактерии с модифицированным ice-геном утратили способность кристаллизовать воду при -1-5 оС. Посев этих генетически модифицированных бактерий на растения в момент распускания почек препятствует колонизации другими бактериями, поэтому растения фактически иммунны для заражения INA-бактериями дикого типа и им не страшны кратковременные заморозки.

В настоящее время большие средства в США и других странах вкладываются в программу получения трансгенных злаковых с генами азотфиксации. Однако при переносе генов азотфиксации в высшие растения, помимо трудностей генетического характера, имеются и другие. Пока не изучена в должной мере регуляция взаимосвязи генов фиксации азота с генами, ответственными за синтез переносчиков электронов и кофакторов, необходимых для функционирования фермента нитрогеназы.

Последняя должна быть защищена от ингибирующего воздействия кислорода. Ведутся также интенсивные исследования генетики растений для подбора эффективных растений-хозяев, а также исследования, направленные на модификацию генома микроорганизмов для получения организмов, способных существовать в симбиозе не только с бобовыми растениями (например, хлебными злаками). Фундаментальные исследования по переносу генов азотфиксации в высшие растения, по-видимому, приведут к многообещающим открытиям и коренному перевороту практики азотного питания растений.

Второе, весьма важное направление применения генетической инженерии, - придание культурным растениям устойчивости к заражению листогрызущими насекомыми. Природные фитопатогены, например бактерии Bacillus thuringiensis (Bt), синтезирующие токсины, эффективные против листогрызущих насекомых, стали источником генов для придания растениям устойчивости к этим вредителям. Синтез токсинов Bt контролируется одним геном, имеющиеся методы позволяют проводить работы, направленные на улучшение существующих продуцентов и продуктов Bt.

Известно, что гены, контролирующие синтез кристаллов Bt, локализованы на небольшом числе плазмид значительной молекулярной массы. Токсический белок, синтезируемый Bt, клонирован в E. coli и B. subtilis, его экспрессия получена даже в течение вегетативной фазы роста. Есть сведения о клонировании белка, токсичного для бабочек, в клетках табака.

В выросшем целом растении табака каждая клетка вырабатывала токсин. Таким образом, растение, приобретшее токсин, само становится устойчивым к насекомым: поедая листья, гусеница погибает, не причинив существенного вреда растению.

В то же время устойчивость к гербицидам, кодируемая одним геном, может вызвать существенные проблемы в практике севооборотов. Так, устойчивое к некоторому препарату растение, культивируемое на определенной площади, на следующий год при смене на этом поле культуры будет выступать по отношению к ней как сорняк, устойчивый к данному гербициду. Это предусматривает необходимость тщательного тестирования всех генно-инженерных растений перед их переносом в полевые условия.

Новый путь модификации генома - применение антисмысловых РНК, т.е. подавление синтеза определенного белка. Введение в клетку комплементарного олигонуклеотида мРНК препятствует считыванию информации. Использование данной технологии позволило получить сорт томатов, сохраняющихся длительное время за счет блокирования функции гена полигалактуроназы (расщепляет углеводы в клетке, стимулируя созревание), или кофе с низким уровнем кофеина в результате введения гена, подавляющего продукцию; т.е. это путь удаления неприятных горьких и прочих веществ из сельскохозяйственной продукции, подавления вирусных инфекций и т.д.

Генетическая инженерия животных направлена на выведение животных с высокими эксплуатационными свойствами.

Методы генетической инженерии совместно с методом клонирования животных позволяют также получать модели для изучения заболеваний человека, процессов старения и формирования злокачественных новообразований. В будущем эти приемы могут быть использованы для разработки новых лекарственных средств и оценки эффективности таких методов лечения, как генная и клеточная терапии. Клонирование животных также предоставляет возможность спасения видов, находящихся под угрозой вымирания.

К биотехнологическим методам репродукции животных относятся искусственное осеменение, индукция родов, трансплантация, регулирование соотношения особей мужского и женского рода в популяции, это также ранняя диагностика беременности, применение гормонов для регулирования репродуктивных функций и роста и пр.

Искусственное разделение эмбриона является рутинным методом клонирования. Метод дает возможность получения большого числа копий животных от высокоценных производителей. Возможно получение большого числа копий однояйцовых близнецов путем разделения зародышей в стадии бластулы или морулы на части. Эти части зародыша вводятся в пустые оболочки яйцеклеток свиньи, помещают в агаровые цилиндры на несколько дней, далее вводят в яйцеводы овец.

Нормально развившиеся зародыши пересаживают хирургическим путем коровам-реципиентам на 6-7 день полового цикла. Выживаемость у половинок составляет до 75 %, у четвертинок -ниже, около 40 %. Образующиеся в результате этого эмбрионы внедряются в матку суррогатной матери, которая обеспечивает их вынашивание и рождение. Так как эмбрионы происходят из одной зиготы, они являются генетически абсолютно идентичными.

Манипуляции на эмбрионах используют для получения эмбрионов различных животных. Подход позволяет преодолеть межвидовой барьер и создавать химерных животных. Таким образом получены, например, овцекозлиные химеры.

Первые эксперименты показали возможность трансформации генома животных генами человека, в США удалось получить свиней, несущих ген гормона роста человека. В Эдинбургском центре биотехнологии получены овцы с перенесенным фактором 9 человека, который секретируется в составе молока.

Новый метод - перенос ядра соматической клетки (или перепрограммирование яйцеклеток) начинается с выделения из организма соматической клетки - любой клетки, не участвующей в процессе репродукции (т.е. любой, кроме половых клеток - сперматозоидов и яйцеклеток). У млекопитающих любая соматическая клетка содержит полный двойной набор хромосом (в каждой паре одна хромосома получена от материнской яйцеклетки, вторая - от отцовского сперматозоида). Геном любой половой клетки состоит только из одного хромосомного набора.

Для создания овцы Долли исследователи переместили ядро соматической клетки, полученной от взрослой овцы, в яйцеклетку, ядро которой было предварительно удалено. После проведения определенных химических манипуляций яйцеклетка с подмененным ядром начала вести себя как свежеоплодотворенная яйцеклетка. В результате ее деления сформировался эмбрион, который был имплантирован суррогатной матери и выношен в течение полного срока беременности. Появление Долли продемонстрировало возможность удаления генетической программы ядра специализированной соматической клетки и его перепрограммирования в лабораторных условиях методом помещения в яйцеклетку.

В течение 5-6 дней яйцеклетка развивается в эмбрион, генетически идентичный животному-донору. Клетки этого эмбриона могут быть использованы для получения любого типа ткани, которая при пересадке не будет отторгаться организмом донора ядра. Этот метод вполне может быть использован для выращивания клеток и тканей для заместительной терапии. Данный метод клонирования животных весьма активно используют в настоящее время.

Совершенствование биотехнологических методов и средств диагностики и лечения, возможности ускоренными методами создавать эффективные породы сельскохозяйственных животных и сортов культурных растений -все это способствует повышению качества жизни человека.

Ощутим вклад биотехнологии в увеличение ресурсов минерального сырья и энергоносителей, а также в охрану окружающей среды. В связи с последним особо значимым становится направление, ориентированное на освоение экологически чистых новых материалов. Создание экологически чистых материалов с полезными свойствами остается одной из ключевых проблем современности. К настоящему моменту объемы выпуска не разрушаемых в природной среде синтетических пластмасс достигли 180 млн т/год, что создало глобальную экологическую проблему.

Радикальным решением этой проблемы является освоение полимеров, способных биодеградировать на безвредные для живой и неживой природы компоненты. В этой связи в последние годы наметился существенный прогресс в области синтеза разрушаемых биополимеров - высокомолекулярных полимерных материалов, способных деградировать в природной среде до безвредных продуктов (диоксида углерода и воды).

КЛЕ́ТОЧНАЯ ИНЖЕНЕ́РИЯ, совокупность методов клеточной биологии, позволяющих конструировать клетки с новыми свойствами. К. и. возникла в кон. 19 в., когда впервые попытались выращивать изолированные кусочки растит. тканей на питательной среде. В 1907 амер. биологу Р. Гаррисону удалось культивировать в капле лимфы клетки зачатка нервной системы зародыша лягушки. В 1-й четв. 20 в. был предложен метод выращивания клеток животных в плазме крови (см. Культура клеток и тканей ). Позднее разработаны приёмы получения разл. вариантов культур клеток растений, животных и человека, методы гибридизации, переноса внутрь клеток отд. органелл или белков, конструирования органелл, генетической инженерии .

Современные направления биотехнологии предполагают внедрение в клетку, в процессы метаболизма, перестройку генов. За использованием подобных манипуляций стоит желание человека добиться создания необходимых продуктов питания и химических веществ. Биотехнология – наука затратная, которая требует не только финансовых вложений, но и фундаментальных знаний в области биологии.

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия предполагает создание клеток нового типа путем их культивирования, гибридизации и реконструкции. Клетки видоизменяют, вводя в них новые хромосомы, ядра, клеточные органоиды.

Направления деятельности клеточной инженерии

Клеточная инженерия научилась культивировать (выращивать) изолированные клетки и ткани на специально подобранной питательной среде в контролируемых условиях (влажность, температура, освещенность). Из одной клетки таким путем получают полноценное растение или клеточную массу (каллус). Такие эксперименты проводят благодаря способности растительной клетки к регенерации и чаще всего применяют для с/х растений и лекарственных трав.

Селекция и клеточная инженерия относятся к неразделимым понятиям. В селекции применяют новые, не стандартные методики:

соматическая гибридизация;
гаплоидия;
селекция на уровне клеток;
преодоление не скрещиваемости сортов или видов растительных культур.

Такие способы позволяют экспериментировать и создавать новые гибриды и сорта, которые невозможно получить традиционными путями, используя только методы селекции.

Генетическая инженерия

Фрагмент молекулы ДНК - носителя наследственной информации в клетке

Генная инженерия, соединив достижения химии и генетики, помогает:

расшифровывать структуру гена;
синтезировать новые гены;
вставлять в живые клетки синтезированные гены, с заранее продуманной программой, для изменения их наследственных свойств.

Внедрение гена из одного организма в другой требует выполнение цепочки последовательных действий:

Выращены трансгенные животные, содержащие геном с не родными генами. Уже получены трансгенные мыши, кролики, свиньи, овцы. Они содержат ДНК, в которой работают чужеродные гены разного происхождения. Животные и растения в качестве наследственного материала получают гены бактерий, дрожжей, млекопитающих, человека.

Важно! Трансгенные организмы устойчивы к факторам внешней среды, вредителям и болезням, наделены теми чертами, которые запрограммировал в них человек.

Клонирование

Удачные эксперименты по клонированию, проведенные на овцах

К сведению: Иногда клонирование путают с искусственным оплодотворением, когда оплодотворенную яйцеклетку вводят в матку будущей матери (родной или суррогатной). Это метод решения проблемы бесплодия, но он не относится к клонированию.

Читайте также: