Реферат микроклональное размножение растений

Обновлено: 07.07.2024

Рефераты и конспекты лекций по географии, физике, химии, истории, биологии. Универсальная подготовка к ЕГЭ, ГИА, ЗНО и ДПА!

На сегодня разработан ряд различных способов биотехнологии микроклонального размножения. В их основе лежат четыре принципиальных подхода:

1) активация развития растительных меристем (апекс побега, пазушные и спящие почки побега);

2) образование адвентивных почек из тканей эксплантаты;

3) индукция соматического эмбриогенеза;

4) дифференциация адвентивных почек в первичной и перевивний каллусных ткани.

Иногда, как отдельную модель выделяют культуру пыльников.

Основным методом микроклонального размножения растений является активация пазушных меристем. Этот метод уже стал промышленным при производстве посадочного материала некоторых культур. Эта модель является наиболее надежной по плодовых и ягодных растений. Впервые эта модель была разработана на землянике в начале 70-х годов прошлого века. Этот метод базируется на снятии апикального доминирования, чего можно достичь двумя путями:

1. Получением побегов нормальных пропорций с последующим их разделением на "однобрунькови микроживци", которые используются как вторичные эксплантаты для повторения цикла размножения. Теоретическая возможность такого способа размножения составляет примерно 10 000 - 1 000 000 побегов в год.

2. Введением в питательную среду веществ с цитокининовым активностью, что приводит к формированию побегов с относительно укороченными междоузлиями, а пазушные почки дают начало новым побегам. Эксплантаты на таких средах приобретают вид пучков маленьких побегов, каждый из которых можно рекультивировать. Теоретически, возможность этого метода может составлять до 15000000000 почек или побегов в год от одного эксплантаты. Считают, что этот метод имеет минимальную степень риска относительно получения неоднородного потомства и частота появления мутантных растений не превышает частоты появления таких при обычном размножении. Метод относительно универсальный и имеет хорошую воспроизводимость в пределах вида и даже рода растений.

Второй метод - это индукция образования адвентивных почек непосредственно тканями эксплантаты. Он основан на способности изолированных частей растений при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и регенерировать целые растения (исключение составляет корневой органогенез). Почти все органы и ткани растений могут образовывать Адвентивная почки. Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих только цитокининов или в сочетании с ауксином в соотношении 10:1 или 100:1. С ауксинов в этом случае чаще всего используют ИОК или НОК.

Этим путем можно размножать нарциссы, лилии, гладиолусы, чеснок, лук, цветную капусту, землянику, малину, яблоню, грушу и другие.

Однако, некоторые исследователи считают, что при размножении таким способом не исключена возможность получения неоднородного потомства. Дело в том, что в тканях эксплантаты могут быть клетки с нарушенной плоидность. Прежде всего это касается тканей, состоящих из клеток, быстро отмирают, например, клетки корневого чехлика. И хотя вероятность регенерации растений из таких клеток относительно низкая, ею нельзя пренебрегать, так как in vitro эти клетки могут получить преимущество в развитии.

В некоторых случаях эффективным способом размножения растений in vitro может быть соматический эмбриогенез - это формирование зародкоподибних структур (эмбриоидов) из соматических клеток в условиях in vitro, которые при переносе на соответствующее питательную среду способны развиваться в целое растение. Соматический эмбриогенез наглядно демонстрирует тотипотентность растительных клеток.

Основное отличие образования зародышей in vitro от in vivo заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуальных вне зародышевым мешком и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, в которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. В некоторых случаях эмбриоидов образуются непосредственно из клеток ткани, культивируемой in vitro, - это так называемый прямой эмбриогенез. В других случаях сначала формируется Калюс, а уже из него развиваются зародыши-это косвенный эмбриогенез.

Эмбриоидов образуются из одиночных клеток, расположенных в основном на поверхности каллуса. Они отличаются плотной цитоплазмой, относительно большим ядром с увеличенным ядрышком, содержат мелкие вакуоли. Это метаболически активные клетки, богатые белками и РНК. Окружающие вакуолизирован клетки выполняют функцию "ткани-няни".

Формирование эмбриоидов в культуре тканей проходит в два этапа. На первом этапе клетки эксплантаты дедиференциюються за счет добавления в питательную среду ауксинов, как правило, 2,4-Д и превращаются в эмбриональные. На следующем этапе из этих клеток развиваются эмбриоидов. Происходит это при уменьшении концентрации ауксина или вообще полного его исключения из состава питательной среды.

Эмбриогенез легче происходит у молодых культурах. По мере удлинения срока культивирования ембриогенна активность клеток ослабляется. Так в моркови эмбриоидов начинают образовываться через 4-6 недель после получения каллуса, оптимальный возраст культуры для индукции соматического эмбриогенеза - 1520 недель 30-40-недельная культура часто теряет ембриогенний потенциал.

Четвертый метод микроклонального размножения - дифференциация адвентивных почек в первичной и перевивний каллусных ткани. Этот метод мало используется для получения посадочного метериала in vitro. Это связано с тем, что при длительном культивировании каллуса наблюдаются изменения плоидности клеток, структурные перестройки хромосом, накопления генных мутаций и уменьшение или и потеря морфогенном потенциала. Поэтому этот метод микроклоноального размножения целесообразно использовать только для тех растений, для которых присуща генетическая стабильность каллусных ткани, а вариабельность между растениями-регенерантов не превышает уровня естественной изменчивости. К таким растениям можно отнести томаты, спаржу, некоторые древесные породы. Через каллусных культур были также размножены сахарная свекла, кукуруза, рис, пшеница, подсолнечник, лен, картофель, огурец.

Для каждого огородника, хоть профессионала, хоть любителя, важно знать, каким образом можно размножать свои посадки. Способов существует достаточно много, и одним из наиболее интересных и действенных является метод микроклонального размножения. Что это такое, как работает и все основные его премудрости - в нашем материале.

Что же это?

Начнем сразу с самого главного. В словосочетании "микроклональное размножение" второе слово понятно всем, а вот первое - только избранным. Проясним ситуацию. Что же есть такое "микроклональное"?

Если говорить "умным" научным языком, то это особый подвид вегетативного размножения с использованием техники под названием "инвитро" (in vitro), который дает возможность получить растения в более короткие сроки. Понятнее и подробнее будем разбираться дальше, и для этого сначала напомним о том, что представляет собой вегетативное размножение, и поясним, что означает термин "инвитро".

В научных дебрях

Из курса школьной биологии нам известно, что размножать растения можно двумя путями: семенным (когда мы разбрасываем в почву семена) и вегетативным. Вегетативное размножение является бесполым, оно происходит с помощью отделения некой части от растения-родителя. Почкование, укоренение молодых побегов, пересадка луковиц - все это вегетативное размножение.

Казалось бы, с помощью семян увеличивать численность растений гораздо проще - нет такой мороки. Однако у этого метода есть немало минусов; в отдельных случаях воспользоваться семенами вообще невозможно - и вегетативный способ, неоспоримое преимущество которого перед первым состоит в сохранении совокупности генов растения-родителя, остается единственно доступным и удобным. Но к сожалению, недостатков хватает и у него. Например, отсутствие нужной эффективности (у таких, допустим, растений, как дуб, сосна и так далее), "пожилые" древесные породы (которым больше 15 лет) не способны размножаться черенкованием, подобные процедуры довольно трудоемки и энергозатратны, не всегда полученные растения соответствуют норме и образцу (могут быть зараженными) - ну и так далее.

И именно для этих случаев существует технология микроклонального размножения растений, которая, как Чип и Дейл, спешит на помощь. Как уже говорилось выше, она осуществляется в технике "инвитро", что с латинского языка переводится как "в пробирке". Таким образом, данная методика позволяет "клонировать" в "пробирке" растение с генами точь-в-точь такими, как и у родительской особи. Это происходит благодаря тому, что клетка способна давать жизнь новому организму под влиянием внешних факторов.

У технологии микроклонального размножения есть, бесспорно, целый ряд достоинств и преимуществ. О них далее и поговорим.

Чем метод микроклонального размножения лучше

Многим! И в первую очередь отсутствием вирусов и инфекций у выведенных растений (потому, что для этого используются особые клетки - они называются меристемными, особенность их заключается в непрестанном делении и наличии физиологической активности на протяжении всей жизни). Также у растений, "добываемых" таким способом, присутствует достаточно высокий объем размножения, а весь селекционный процесс проходит гораздо быстрее. С помощью технологии микроклонального размножения возможно осуществить эту процедуру и для тех растений, для которых обычными, "традиционными" методами это сделать крайне проблематично. Наконец, в технике "инвитро" выращивать растения можно в течение всего года, не ограничиваясь каким-либо одним промежутком. Так что плюсов у подобной методики действительно много. И прежде чем углубляться в суть микроклонального размножения растений, коснемся немного истории возникновения данного способа. Кому и как пришла в голову такая идея?

История метода

Первым успешный опыт над орхидеями произвел ученый-француз еще в пятидесятых годах прошлого столетия. При этом не он стал изначально заниматься техникой "инвитро" - ее разрабатывали и до него, и вполне успешно. Однако именно Жан Морель - таково имя француза-экспериментатора - решился на подобный опыт и осуществил его вполне удачно. Работы же, рассказывающие про данную технику, появились еще на несколько десятилетий до него - в двадцатых годах прошлого же столетия.

"Пробирочный клон" древесного растения - конкретно осины - был получен в шестидесятых годах. Работать с деревом оказалось труднее, нежели с цветами и иными видами растений, однако и эти трудности через определенный промежуток времени были преодолены. В настоящее время более 200 видов деревьев из более чем сорока семейств можно получать "пробирочным" способом. Технология микроклонального размножения растений оправдывает себя и дает свои плоды.

Подробнее о методе

Как уже можно было догадаться, в разработке и применении микроклонального размножения растений существует много своих тонкостей. Так, например, есть особые этапы у данной технологии, соблюдать которые для получения желаемого результата просто необходимо. Нужно понимать, что пренебрежение последовательностью действий или каким-то этапом может принести абсолютно не тот итог, на который рассчитывает селекционер. Итак, об этапах данной методики мы и поговорим далее.

Этапы микроклонального размножения растений

Подобная технология предполагает четыре "ступеньки" на пути к получению заветных "клонов". Постараемся рассказать о них как можно более ненаучно, поскольку термины биотехнологии - вещь все же не самая понятная для широкой аудитории. И, кстати, один из этих терминов тут же и поясним: эксплант - так ученые в данной области именуют отделенный от родительского организма новый организм. То есть тот самый "подопытный", который и будут выращивать далее.

Итак, перейдем к нашим "ступенькам". Первый шажок - это выбор собственно родителя - или донора. К этому вопросу следует подойти с максимальной серьезностью и ответственностью, потому что для получения хорошего, крепкого, здорового растения мы и "оригинал" должны подобрать такой же. Яблоко-то от яблони, как известно, недалеко падает.

На этом же этапе необходимо изолировать и стерилизовать экспланты, после чего организовать такие условия, чтобы рост этих самых эксплантов в технике "инвитро" происходил максимально комфортно.

Вторая "ступенька" проще некуда - это само размножение. Оно возможно через месяц-полтора, когда мини-череночки уже достигли размера горошинок и имеют зачатки всех вегетативных органов. За ним, в свою очередь, следует укоренение побегов, которые получились на предыдущем этапе. Его проводят, когда растение уже образовало хорошую корневую систему.

Последний шаг - помощь растениям в адаптации к "жизни" в почве, выращивание их в теплице, последующая пересадка в землю либо реализация - так сказать, "отправление в большой мир". Этот этап, как это ни странно, наиболее трудоемкий и многозатратный, поскольку очень часто, к сожалению, бывает такое, что, оказавшись в почве, растение начинает терять листья, останавливаться в росте – а затем и вовсе оно может погибнуть. Все это происходит потому, что пробирочные растения при пересадке в грунт теряют очень много воды. Следовательно, необходимо в процессе пересаживания предотвратить подобную возможность – для чего рекомендуется опрыскивать листья 50-процентным водным раствором глицерина или смесью парафина. Делать это необходимо на протяжении всего акклиматизационного периода. Кроме того, в некоторых случаях целесообразной является намеренная микоризация – то есть искусственное внедрение в ткани растения грибов, которые заражают его. Проводится это для того, чтобы растение получило как можно больше полезных питательных и органических веществ, а также было защищено от различных патогенов.

Вот и все этапы микроклонального размножения, в которых, как мы видим, нет ничего глобально сложного или сверхъестественного, однако, повторим еще раз, все это мероприятие требует большой ответственности и внимания.

Влияющие факторы

Сортовые, видовые и физиологические особенности растения-родителя – оно должно быть здоровым, интенсивно расти, при необходимости обработано температурным воздействием.
Возраст, строение и происхождение экспланта.
Длительность культивирования.
Эффективность стерилизации.
Удачная питательная среда.
Гормоны, минеральные соли, углеводы, витамины.
Температура и освещение.

Что нужно для микроразмножения

К растениям, которые будут размножать вышеуказанным образом, предъявляется одно очень важное требование - помимо того, что они должны быть здоровы. Это непременное сохранение генетической стабильности на протяжении всех вышеупомянутых этапов. Такому требованию лучше всего отвечают апикальные меристемы, а также пазушные почки стеблевого происхождения, поэтому именно их и предпочитают использовать для интересующей нас процедуры.

Вышеупомянутые термины должны быть непонятны простому обывателю. Ниже попробуем растолковать, что это за звери такие и с чем их подавать к столу.

Апикальные меристемы

Выше мы уже упоминали о существовании особых меристемных клеток - иначе говоря, образовательных. Это клетки, которые непрестанно делятся, всегда находятся в состоянии физической активности - благодаря чему нарастает масса растения и образуется особая ткань этого самого растения. Она и называется меристемой. Видов меристем бывает много разных. В целом их можно поделить на общие и специальные. В понятие общих меристем входят три группы, которые как бы вытекают одна из другой. Самая первая меристема у растения - меристема зародыша, из которой как раз-таки и берет начало интересующая нас апикальная меристема.

Слово "апикальный" произошло от латинского "апикс" и переводится оно как "вершина". Таким образом, это верхушечная система тканей, находящаяся на самом кончике зародыша - и именно из нее впоследствии формируется побег и начинается его рост и развитие. Значит, говоря об апикальной меристеме как об объекте для микроклонирования, мы должны понимать, что берем для наших нужд верхушечку зародыша.

С пазушными почками немного проще. Что такое почки, знают все. Пазушная почка - та, что родилась из пазухи листа. Пазуха листа, в свою очередь, это угол между листом и его стеблем; оттуда будет как раз и расти почка либо же побег. Вот эту самую часть, то есть будущий боковой побег, и берут тоже для последующего микроразмножения.

Теперь, когда свет над завесой тайны немного пролит, можно перейти, наконец, и к методам микроклонального размножения растений.

Способы размножения микро-образом

Микроклональное размножение тем еще хорошо, что предполагает в своей основе возможность использования сразу нескольких различных техник. Постараемся как можно проще осветить каждую из них. Всего насчитывается четыре метода микроклонального размножения растений.

Первый. Активация уже существующих в растении меристем

Что это значит? В растении, даже таком крошечном микрокусочке, уже заложены определенные меристемы. Это верхушка стебля и пазушные его почки. Для того чтобы микроклонировать растение, можно "в пробирке" "разбудить" эти спящие доселе меристемы. Достигается это либо удалением верхушечной меристемы микроросточка, вернее, его стебля, а затем черенкованием побега в технике "инвитро" либо же внедрением в питательную среду растения особых веществ, которые активизируют рост и развитие пазушных побегов. Метод активации "спящих" меристем является основным, наиболее популярным и действенным, а разработан он был еще в семидесятых годах минувшего столетия. Первым "подопытным кроликом" в применении микроклонального размножения растений подобного типа стала земляника. Важно заметить, впрочем, что бесконечно размножать культуры подобным образом запрещено, поскольку это чревато потерей способности к укоренению, а в некоторых случаях – гибелью растения.

Второй. Появление адвентивных почек силами самого растения

У любой изолированной части растения есть поистине волшебная способность, своя суперсила. Если при микроклональном размножении питательная среда растения и все прочие условия жизни благоприятны и комфортны, то оно может восстанавливать недостающие части. Происходит своеобразная регенерация - ткани растения образуют адвентивные, или придаточные почки - то есть такие, что возникают как бы "из старых запасов", а не из новых тканей. Такие почки необычны тем, что появляются, как правило, в тех местах, откуда их возникновения никак не ждешь - на корнях, к примеру. Именно подобным способом часто размножают многие цветы, опять же - землянику. Это второй по популярности и действенности метод микроклонального размножения растений.

Третий. Соматический эмбриогенез

Активно подобным методом микроклонального размножения растений пользуются при размножении масличной пальмы. Все дело в том, что, поскольку у нее нет ни побегов, ни боковых ростков, вегетативное размножение ее невозможно (ну или, во всяком случае, весьма и весьма затруднительно), как невозможно и черенкование. Таким образом, вышеуказанная методология единственная из всех наиболее доступна и оптимальна при работе с данным растением.

Четвертый. Работа с каллусной тканью

Данный метод из всех четырех вышеприведенных является, пожалуй, наименее востребованным. В первую очередь, это связано с тем, что слишком частое разделение клеток каллусной ткани способно привести к генным нарушениям и мутациям разного уровня. Поскольку сохранение генотипа очень важно для микроклонального размножения, и культура тканей должна соблюдаться на высшем уровне. Кроме того, при вышеуказанных нарушениях проявляются и иные недостатки: низкорослость, восприимчивость к болезням и так далее. Впрочем, в некоторых случаях исключительно подобным способом и возможно размножение – например, для сахарной свеклы иного метода попросту не подобрать.

Далее мы для примера скажем пару слов о клонировании конкретных растений, но прежде –нужно поделиться информацией об оздоровлении растений, использующихся в качестве посадочного материала. Каким образом этого можно добиться?

Оздоровление

О клонировании картофеля

При микроклональном размножении картофеля его выращивают в пробирках по два черенка, пробирки помещаются под свет люминесцентных ламп силой от шести до восьми тысяч люкс, температура сохраняется ночью в пределах восемнадцати градусов, днем – приблизительно двадцать пять. В России именно картофель выращивают с помощью клонирования наиболее активно.

О клонировании яблони: что нужно знать

В микроклональном размножении яблони широко применяется первый способ – размножение с помощью пазушных почек. Отмечается высокая способность данной культуры к укоренению и приживаемость большего количества эксплантов.

Их помещали в жидкую питательную среду, которая постоянно – ежедневно – обновлялась. Температура для пробирочных растений также поддерживалась на уровне двадцати пяти градусов днем, эксперимент проводился в течение трех-четырех недель.

Интересные факты

Такова информация о микроклональном размножении растений – теме насколько сложной, настолько и интересной.

Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.

Это обусловлено следующими причинами:

- не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);

- практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10—15 лет;

- не всегда удается получать стандартный посадочный материал (возможность накопления и передачи инфекции);

- трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок;

- неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

- получение генетически однородного посадочного материала;

- освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

- высокий коэффициент размножения (105—106 — для травянистых, цветочных растений, 104—105 — для кустарниковых древесных, 104 — для хвойных);

- сокращение продолжительности селекционного процесса;

- ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

- возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;

Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений. Ж. Морель в своих работах также использовал верхушку цимбидиума (сем. орхидные) состоящую из конуса нарастания и двух-трех листовых зачатков, из которой при определенных условиях наблюдал образование сферических сфер — протокормов. Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культивировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной среде до образования листовых примордиев и корней. В результате им было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно было получать в большом количестве высококачественный и генетически однородный, безвирусный посадочный материал.

В России работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Под руководством чл.-корр. РАН, академика РАСХН Бутенко Р. Г. были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии. Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение растений-регенерантов.

Однако область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению. Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использование техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений. В настоящее время в этом направлении наметился положительный сдвиг.

Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов XX столетия и связаны с именем французского ученого Готре.

В них сообщалось о способности камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны к каллусогенезу in vitro. В последующих работах 40-х годов было выяснено о способности различных тканей вяза листового к образованию адвентивных почек. Однако дальнейший рост и формирование побегов авторами не были получены. Лишь к середине 60-х годов Матесу удалось получить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены до почвенной культуры. Культивирование тканей хвойных город in vitro долгое время использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования ювенильных и тем более взрослых тканей, изолированных с растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные, характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изолированных тканях окисляются различными фенолазами. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентивных почек которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью. Однако, несмотря на все трудности, ученые все чаще используют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений В настоящее время насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др.), а работы в этом направлении ведутся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева, Одессы, Ялты и др.

Этапы микроклонального размножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.

На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4—24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5—1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

1) выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2—24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20—50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);

2) непосредственное культивирование микропобегов в течение 3—4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1—5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений — весна или начало лета.

Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85—90° С в течение 1—2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).

Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20—22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65—90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.

Через 20—30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.

Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость.

Методы клонального микроразмножения

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

1. Активация пазушных меристем.

2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.

3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.

4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.

5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.

6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Н.В. Катаева и Р.Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).

2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo :

а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;

б) индукция соматического эмбриогенеза;

в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений - активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования.

Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.

Микроклональное размножение растений делится на два этапа – непосредственно размножение растительного материала in vitro (проводится в специализированной лаборатории) и последующая адаптация микроскопических растений (может проводиться любым желающим в домашних условиях).

В целом А.Д. эта технология очень нравится, в планах расширение набора выращиваемых меристемных культур и сортов и продолжение наблюдений. В частности, пока открыт вопрос, не изменяется ли скороплодность плодовых культур при микроклональном размножении. Также интересно посмотреть, будет ли влиять выращивание деревьев на своих корнях на вкусовые качества плодов (в трудах Бербанка и Мичурина есть сведения о положительном влиянии корнесобственности).

Читайте также: