Произвести посев выделенной чистой культуры бактерий на среды для изучения биохимических свойств

Добавил пользователь Валентин П.
Обновлено: 19.09.2024

Учебно-методическое пособие для внеаудиторной и кружковой работы по дисциплине "Основы микробиологии и иммунологии" для специальностей 060501 Сестринское дело и 060102 Акушерское дело.

В лабораторной диагностике инфекционных болезней изучение ферментативной активности бактерий имеет огромное значение в ходе бактериологического метода исследования. Изучая биохимическую активность микроорганизмов, студенты не только глубоко познают особенности жизнедеятельности бактерий, но и знакомятся с одним из важнейших методов лабораторной диагностики инфекционных болезней.

Изучение данной темы предполагает использование активных методов обучения в сочетании с традиционными:

в занятии предусмотрены этапы активизации базисных знаний (в данном случае по химии и теории микробиологии),

демонстрация преподавателем результатов опытов с ферментами бактерий, самоподготовка с использованием УМП,

самостоятельное решение проблемы в конкретной ситуационной задаче.

В ходе занятия студенты овладевают навыками исследовательской работы. Решение ряда теоретических вопросов позволяет студентам достичь конкретных практических целей в ходе бактериологического метода исследования.

Процесс работы над темой организован таким образом, что студент вынужден осмыслить основную проблему темы, найти ключ к её решению, изучив опорный конспект, и сделать вывод на основе логического обобщения результатов исследования. Работа студентов над данной темой не только даёт определённый объём информации, но и решает важнейшую педагогическую задачу – учит активно мыслить, обобщать результаты исследований, делать выводы. Важно, что наряду с коллективной формой обучения учебно-методическое пособие предполагает также индивидуальную самостоятельную работу каждого обучающегося в ходе решения конкретных ситуационных задач.

P.S. К сожалению, при публикации утрачены цветные иллюстрации в пособии. Полную версию работы можно получить при контаткте непосредственно с автором.

Вложение	Размер
izuchenie_bioh_akt_bakt.docx	287.11 КБ

Предварительный просмотр:

Государственное бюджетное образовательное учреждение

среднего профессионального образования

«Московское медицинское училище № 15

Учебно - методическое пособие

для проведения внеаудиторной работы и кружковой работы

"Изучение биохимической активности бактерий"

Составлено в соответствии

с Государственными требованиями

к минимуму содержания и уровню

по специальностям: Сестринское дело 060501

Акушерское дело 060102

РАССМОТРЕНО И ОДОБРЕНО УТВЕРЖДАЮ

НА ЗАСЕДАНИИ ПЦК №3 ЗАМЕСТИТЕЛЬ ДИРЕКТОРА

ПРОТОКОЛ № _______ ПО УЧЕБНОЙ РАБОТЕ

_____________/Парфёнова Л. Ф./

Биохимическая, или ферментативная, активность микроорганизмов лежит в основе тех изменений, которые происходят под влиянием метаболизма бактерий как во внешней среде, так и в организме человека. Ферментативная деятельность бактерий используется в пищевой и фармацевтической промышленности, сельском хозяйстве и генной инженерии. Ферменты патогенных бактерий участвуют в формировании патологических процессов в органах и тканях при инфекционной болезни. В лабораторной диагностике инфекционных болезней изучение ферментативной активности бактерий имеет огромное значение в ходе бактериологического метода исследования. Изучая биохимическую активность микроорганизмов, студенты не только глубоко познают особенности жизнедеятельности бактерий, но и знакомятся с одним из важнейших методов лабораторной диагностики инфекционных болезней.

Изучение данной темы предполагает использование активных методов обучения в сочетании с традиционными:

в занятии предусмотрены этапы активизации базисных знаний (в данном случае по химии и теории микробиологии),

самостоятельное решение проблемы в конкретной ситуационной задаче.

Процесс работы над темой организован таким образом, что студент вынужден осмыслить основную проблему темы, найти ключ к её решению, изучив опорный конспект, и сделать вывод на основе логического обобщения результатов исследования. Работа студентов над данной темой не только даёт определённый объём информации, но и решает важнейшую педагогическую задачу – учит активно мыслить, обобщать результаты исследований, делать выводы . Важно, что наряду с коллективной формой обучения учебно-методическое пособие предполагает также индивидуальную самостоятельную работу каждого обучающегося в ходе решения конкретных ситуационных задач.

Уметь 1) обнаружить ферменты бактерий с помощью специальных питательных сред;

2) использовать результаты исследования биохимической активности бактерий для определения вида патогенных микроорганизмов.

особенности белкового и углеводного обмена патогенных бактерий;
значение изучения биохимической активности патогенных бактерий в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

Активизация базисных знаний

Освоение теории биохимии бактерий.

Самостоятельная практическая работа с УМП.

Общее время занятия

Методическое:

Учебно-методическое пособие "Изучение биохимической активности микроорганизмов".
Учебники: "Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии" под ред.А.А.Воробьёва и Ю.С. Кривошеина. Изд. "Мастерство". Москва, 2012 г.

Материальное:

Слайды для интерактивной доски.
Цветные карандаши.

Имитация чистых культур микроорганизмов - взвесь в физиологическом растворе; малый цветной ряд Гисса до посева и тот же ряд после суточного культивирования в термостате после посева.

2.3.Пробирки с мясо-пептонным бульоном и индикаторными бумажками для определе-

ния индола и сероводорода до посева чистой культуры и то же после посева через

сутки культивирования в термостате (имитация) .

Освоение теории биохимии бактерий.

Письменно ответьте на вопросы, используя опорный конспект:

Демонстрация углеводных и белковых сред с посевами микроорганизмов.

Устно ответьте на вопросы:

Как изменяются углеводные среды под воздействием микробов?
Почему изменяются углеводные среды под воздействием микробов?
Как изменяются белковые среды под воздействием микробов?
Почему изменяются белковые среды под воздействием микробов?
Как обнаруживают изменения в углеводных средах под воздействием бактерий?
Как обнаруживают изменения в белковых средах под воздействием бактерий?
Как используют данные о сахаролитической и протеолитической активности бактерий в диагностике инфекционного заболевания?

Решите ситуационную задачу, используя полученную на занятии информацию, данные задачи и справочную таблицу.

Произвели посев культуры бактерий, выделенных у больного, на среды Гисса и на пептонную воду.Через 24 часа культивирования обнаружено: в средах с глюкозой, лактозой, маннитом и мальтозой цвет среды изменился с жёлтого на ярко – розовый и выделились пузырьки газа; в среде с сахарозой произошло помутнение без изменения цвета среды. Реактивная бумажка на сероводород почернела, а реактивная бумажка на индол стала малиновой.

Задание: 1. Зарисуйте результат проведённого исследования (2 –ой день). Расставьте под пробирками значки, обозначающие сахаролитическую и протеолитическую активность бактерий.

2. Используя данные своего исследования и справочную таблицу, определите вид патогенных бактерий, выделенных у больного.

ГРАФИЧЕСКАЯ СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

МИКРООРГАНИЗМОВ (1 вариант)

Первый день – посев микроорганизмов на среды Гисса и мясо – пептонный бульон для определения сахаролитической и протеолитической активности.

Глюкоза Лактоза Маннит Мальтоза Сахароза МПБ

Второй день: учёт результатов исследования. Зарисовать согласно условию задачи.

Произвели посев культуры бактерий, выделенных у больного, на среды Гисса и на пептонную воду. Через 24 часа культивирования обнаружено: в средах с глюкозой, маннитом и мальтозой цвет среды изменился с жёлтого на ярко – розовый и выделились пузырьки газа; в среде с лактозой и сахарозой произошло помутнение без изменения цвета среды. Реактивные бумажки для определения сероводорода и индола не изменились.

ГРАФИЧЕСКАЯ СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ (2 вариант)

Глюкоза Лактоза Маннит Мальтоза Сахароза МПБ

Второй день: учёт результатов исследования. Зарисовать согласно условию задачи.

Произвели посев культуры бактерий, выделенных у больного, на среды Гисса и на пептонную воду. Через 24 часа культивирования обнаружено: в средах с глюкозой, маннитом и мальтозой цвет среды изменился с жёлтого на ярко – розовый и выделились пузырьки газа; в среде с лактозой и сахарозой произошло помутнение без изменения цвета среды. Реактивная бумажка для определения сероводорода почернела, а реактивная бумажка для определения индола не изменилась.

1. Зарисуйте результат проведённого исследования (2 –ой день). Расставьте под пробирками значки, обозначающие сахаролитическую и протеолитическую активность бактерий.

ГРАФИЧЕСКАЯ СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

МИКРООРГАНИЗМОВ (3 вриант)

Глюкоза Лактоза Маннит Мальтоза Сахароза МПБ

Второй день: учёт результатов исследования. Зарисовать согласно условию задачи.

I. Определение сахаролитических ферментов бактерий.

Сахаролитическая активность микроорганизмов – это способность бактерий с помощью ферментов разлагать сахара до более простых соединений – кислоты, газа, альдегидов. Эти вещества можно обнаружить в питательной среде с помощью специальных химических веществ – индикаторов.

II. Определение протеолитических ферментов бактерий.

Протеолитическая активность микроорганизмов – это способность бактерий с помощью протеолитических ферментов расщеплять молекулы белка до аминокислот и простых веществ – сероводорода, индола и др.

Для обнаружения протеолитических ферментов исследуемую культуру засевают на мясо – пептонный бульон или пептонную воду. Под пробки пробирок вводят индикаторные бумажки, пропитанные реактивными растворами.

Если бактерии разлагают белок с образованием сероводорода , то реактивная бумажка окрашивается в чёрный цвет. Некоторые бактерии разлагают белок с накоплением в окружающей среде индола. В этом случае индикаторная бумажка окрашивается в малиновый цвет. Присутствие продуктов распада белка в пробирке - сероводорода и индола - свидетельствует о протеолитической активности бактерий и обозначается на схеме H 2 S (+) и индол (+) соответственно .

III. Протеалитическую активность бактерий можно изучать на желатиновой среде. При посеве на желатин бактерии с сильной протеолитической активностью разжижают его. Форма разжижения желатина характерна для некоторых видов бактерий и используется как видовой признак в лабораторной диагностике инфекций.

1. Выделение чистой культуры является основой бактериологической работы, т.к. в практической деятельности приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микробов (гной, испражнения и т.д.), идентификация же вида возможна только тогда, когда бактерии получены в чистом, изолированном виде.

2. Для получения чистой культуры необходимо отделить бактериальные клетки разных видов друг от друга. По способу их отделения различают две основные группы методов выделения чистых культур: а) методы, основанные на механическом разделении; б) методы основанные на различиях в биологических свойствах микроорганизмов.

3. Чаще всего используются механические способы разъединения бактериальных клеток – специальные методы посева:

а) рассев шпателем по Дригальскому: берут три чашки Петри с питательным агаром; на первую чашку наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности агара; затем шпатель переносят во вторую чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды; аналогичным образом производят посев шпателем и в третьей чашке. На первой чашке вырастает максимальное количество колоний; на третьей – минимальное, где вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры;

б) рассев петлей ("штрихами" или "сеткой"): берут одну чашку Петри с питательным агаром; петлей на небольшом участке питательного агара делают сплошной посев исследуемого материала, а затем, отступив от засеянной площадки, делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим количеством клеток вырастут отдельные колонии;

в) фильтрация: исследуемый материал пропускают через специальные фильтры с определенным диаметром пор и таким образом разделяют микроорганизмы по величине (в основном применяется для очистки вирусов от бактерий).

Т.о., при помощи специальных методов посева добиваются роста микроорганизмов на плотных питательных средах в виде изолированных колоний различных видов бактерий, содержащихся в исходном материале в виде смеси, т.е. получают чистую культуру из одной клетки, а далее осуществляют ее пересев.

4. Биологические способы выделения основаны на различиях в биологических свойствах микроорганизмов:

а) метод Шукевича – исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, подвижные формы микробов при размножении как бы "вползают" на поверхность агара из конденсационной воды (Proteus vulgaris), отсевая верхние края культуры в воду свежескошенного агара, и, повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру;

б) метод прогревания – прогревают материал при 80° С на водяной бане 10-15 минут, при этом вегетативные формы погибают, а споры остаются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают (этот метод позволяет отделить споровые формы от неспоровых);

в) бактериостатический метод – при посеве в исходный материал добавляют некоторые химические вещества или антибиотики, которые угнетают рост одних микроорганизмов, не влияя на другие (например, пенициллин задерживает рост грамположительных микроорганизмов, не влияя на грамотрицательные; 5 % р-р H₂SO₄ убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает);

г) метод обогащения – посев на элективные питательные среды;

д) метод заражения лабораторных животных или растений – заражают исследуемым материалом восприимчивые к возбудителю виды животных или растений; после появления признаков заболевания производят посев органов и тканей на питательные среды (применяют для выделения патогенных видов микроорганизмов и отделения их от сапрофитов).

5. Для выделения чистых культур большинства бактерий обычно затрачивается не более 2-3 суток (для выращивания микобактерий туберкулеза – 4-6 недель). Процесс выделения чистой культуры можно разделить на три этапа: а) отделение чистой культуры; б) накопление чистой культуры; в) идентификация – заключение о видовой принадлежности.

6. Первый этап (1-ый день):

а) из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму (или другим методом) и микроскопируют;

б) производят посев исследуемого материала (смеси бактерий) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при 37° С на 24-48 часов (на этом этапе можно использовать и какой-либо биологический способ).

Второй этап (2-ой день):

а) наблюдают результаты посева и проводят описание колоний разных видов по следующим признакам: размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция;

б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму для изучения морфологических и тинкториальных свойств; убеждаются в том, что колония содержит один вид бактерий;

в) осуществляют пересев одной или нескольких различных изолированных колоний в отдельные пробирки со скошенным МПА для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37° С 24 часа.

Третий этап (3-ий день):

а) отмечают характер роста выделенной чистой культуры на МПА (визуально она характеризуется однородным ростом);

б) готовят мазок, окрашивают по Граму (или другим методом) и микроскопируют; при наличии чистой культуры обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки (исключение – полиморфные организмы);

в) производят посев на жидкие и полужидкие среды Гисса и МПБ для изучения биохимических (сахаролитических и протеолитических) свойств чистой культуры; оставляют в термостате при 37° С на 24 часа;

г) проводят идентификацию выделенной чистой культуры по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и др. свойствам; делают окончательный вывод о видовой принадлежности выделенной чистой культуры.

Морфологические признаки – форма, расположение и размеры бактериальных клеток.

Тинкториальные признаки – отношение к различным красителям. Эти признаки изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами (например, по Граму) и нативных препаратов.

Культуральные признаки – морфологические особенности колоний и характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.

Биохимические признаки – способность ферментировать белки, углеводы и другие соединения с образованием различных продуктов (определяются набором ферментов).

В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если это является достаточным для их идентификации.

В необходимых случаях проводят изучение других признаков, например, восстановление нитратов, декарбоксилирование аминокислот, образование оксидазы, плазмокоагулазы, фибринолизина и других ферментов, а также определение антигенной структуры, чувствительности к фагам, вирулентности и т.д. Для этого проводят дополнительные исследования по определению соответствующего маркера (фермента, антигена, чувствительности к фагам).

Чистой культурой считается совокупность микроорганизмов, принадлежащих к одному виду. Получение данного материала является необходимым моментом исследования в выполнении лабораторных диагностических методик. Для выделения чистых культур бактерий используют мазки из крови, мокроты, фекалий, исследуют гнойный, а также другой биологический материал. В естественных условиях (в воздухе, воде, почве), продуктах пищевого назначения, в трупах (человеческих, животных) содержатся ассоциации различных видов микроорганизмов.

Отделение чистой культуры важно для подробного изучения свойств микробов: морфологических, культуральных, биохимических, а также антигенных. По результатам данных методик исследования можно установить принадлежность возбудителя к определенному виду и типу, иными словами, выполнить его идентификацию.

Свойства микроорганизмов, учитываемые при выделении культуры

Принципы биологического разъединения бактерий подразумевают учет особенностей жизнедеятельности микробов с целью выбрать наиболее оптимальные методы исследования. Выбранные методы должны соответствовать возбудителю по определенным параметрам.

Тип дыхания. Среди бактерий выделяют группы аэробных и анаэробных представителей. Для получения анаэробных микробов материал для исследования прогревают. Следующий этап – культивирование микроба в анаэробных условиях. Методики получения аэробных и анаэробных бактерий различны.
Спорообразование. Способность некоторых бактерий к спорообразованию обеспечивает защиту и сохранность микроорганизмов.
Устойчивость бактерий к агрессивному воздействию щелочей и кислот. Устойчивость некоторых видов бактерий к данным веществам обеспечивает максимальное очищение исследуемого материала от примеси других бактерий с применением растворов щелочи либо кислоты.
Подвижность бактериальных организмов. Для отделения чистой культуры подвижных микроорганизмов используются методы отделения культур микробов в капле конденсата.
Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам, некоторым химическим веществам и другим антимикробным средствам. Для некоторых возбудителей наиболее предпочтительны методы выделения культур с применением селективных (специфических) питательных сред.
Антибиотики. Очищают материал от дополнительных микроорганизмов.
Способность бактерий проникать сквозь неповрежденные кожные покровы. Это свойство присуще некоторым разновидностям, которые обладают факторами агрессии.
Чувствительность животных к некоторым болезням инфекционного генеза.

Методики проведения оценки возбудителя

Для получения чистых культур бактериальных клеток применяется ряд методов. Каждый из них применяется в той или иной ситуации и имеет последовательные четкие этапы получения колоний возбудителя заболевания. Рассмотрим наиболее популярные.

Методика Пастера

Представляет собой разведение чистых культур в среде для бактериального роста (жидкой консистенции) до получения концентрации с 1 клеткой на объем жидкости. Данный метод выделения имеет важнейшее историческое значение.

Методика Коха

Посевы обычно проводят с 3-4 последних разведений, так как бактерий там уже мало. Таким образом, при росте микробов на питательной среде проявляются обособленные колонии микроорганизмов, которые рождаются из единственной материнской клетки. Затем из глубины агара можно выбрать изолированную колонию, и пересеять ее на свежую питательную среду. Следующий этап – идентификация и выделение возбудителя.

Методика Шукевича

При данном методе отделения чистой культуры подвижные клеточные организмы (протей) поднимаются на верхушку скошенного агара, а неподвижные формы не меняют своего расположения на среде посева. Путем пересевания верхних краев проросшей культуры, можно вывести чистую бактериальную культуру.

Методика Дригальского

Способ Дригальского довольно широко используется в исследовании биологического материала путем разведения культур в пробирке с бульоном либо с физиологическим раствором.

Следующий этап: одну каплю полученного раствора при помощи стерильного шпателя из стекла распределяют равномерно по поверхности среды питания в 1-ой чашке. Потом, не прожигая шпатель на огне, делают им же посев на 2-ой и 3-ей чаше. Суть метода Дригальского заключается в том, что с каждым последующим посевом культур концентрация бактерий (аэробов) все меньше. На 3-ей чашке они распределяются довольно обособленно, каждая бактериальная клетка при этом дает клональные клетки (в виде изолированной колонии). Их пересевают на скошенный агар для накопления возбудителей.

Методика Вейнберга

Определенные затруднения вызывает выделение чистых культур анаэробных возбудителей, если микроорганизмы не гибнут при контакте с кислородными молекулами. Суть методики заключается в выведении анаэробных микробов (в составе материала) в слегка остывшей (45-50°С) расплавленной среде питания (агарозированной). Проводят 6-10 разведений. Затем идет следующий этап: необходимо быстро охладить состав в пробирке и залить ее поверхность смесью из масла вазелина и парафина, что препятствует проникновению воздуха и способствует развитию анаэробных условий.

При благоприятном посеве прорастают изолированные колонии на второй день, которые можно извлечь из пробирки путем ее нагревания при помощи горелки. Из разрезанного агарового столбика петлей набирают культуры для дальнейшего исследования. Полученные колонии размещают в жидкую питательную среду, на чем этапы выделения колонии анаэробных возбудителей можно завершить.

Методика Хангейта

Ее часто применяют для выделения аэробных микробов, обладающих высокой кислородочувствительностью. В проведении такого выделения культуры аэробов применяется методика вращения пробирок.

Методы засевания аэробных бактерий предполагают выведение их на агаризированной расплавленной среде. Наличие инертного газа в пробирке дает возможность вырастить изолированные колонны аэробных бактерий таким образом, что выделенные культуры аэробов хорошо можно увидеть даже невооруженным глазом на 2-3 день.

Микроманипулятор

Это методика выделения отдельных бактериальных клеток путем применения микроманипулятора. Микроманипулятор представляет собой специальный прибор, которым можно выловить из суспензии одну клетку, а также обеспечить возможность посева культуры в пробирку.

Дальнейшая идентификация возбудителя проводится с учетом всех перечисленных свойств возбудителя (аэробов и анаэробов), а также особенностей их взаимодействия с различными веществами.

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.

Свойства микроорганизмов, учитываемые при выделении культуры

Тип дыхания. Среди бактерий выделяют группы аэробных и анаэробных представителей. Для получения анаэробных микробов материал для исследования прогревают. Следующий этап – культивирование микроба в анаэробных условиях. Методики получения аэробных и анаэробных бактерий различны.
Спорообразование. Способность некоторых бактерий к спорообразованию обеспечивает защиту и сохранность микроорганизмов.
Устойчивость бактерий к агрессивному воздействию щелочей и кислот. Устойчивость некоторых видов бактерий к данным веществам обеспечивает максимальное очищение исследуемого материала от примеси других бактерий с применением растворов щелочи либо кислоты.
Подвижность бактериальных организмов. Для отделения чистой культуры подвижных микроорганизмов используются методы отделения культур микробов в капле конденсата.
Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам, некоторым химическим веществам и другим антимикробным средствам. Для некоторых возбудителей наиболее предпочтительны методы выделения культур с применением селективных (специфических) питательных сред.
Антибиотики. Очищают материал от дополнительных микроорганизмов.
Способность бактерий проникать сквозь неповрежденные кожные покровы. Это свойство присуще некоторым разновидностям, которые обладают факторами агрессии.
Чувствительность животных к некоторым болезням инфекционного генеза.

Методики проведения оценки возбудителя

Методика Пастера

Методика Коха

Методика Шукевича

При данном методе отделения чистой культуры подвижные клеточные организмы (протей) поднимаются на верхушку скошенного агара, а неподвижные формы не меняют своего расположения на среде посева. Путем пересевания верхних краев проросшей культуры, можно вывести чистую бактериальную культуру.