Посев вирусов на куриных эмбрионах

Добавил пользователь Евгений Кузнецов
Обновлено: 15.09.2024

В 1974 году Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) предложила использовать для производства медицинских биологических препаратов (МИБП) линии диплоидных клеток (1), а позднее и линии гетероплоидных клеток (2). К сожалению, в России до настоящего времени большая часть требуемых препаратов выпускается по-прежнему на первичных культурах клеток.

В лаборатории культур ткани Института было установлено более 100 линий перевиваемых клеток человека, обезьян, крупного рогатого скота, овец, свиней, хомяков, тхорзофреток, морской свинки, кролика. Наиболее перспективные из них сохраняются в жидком азоте.

Линии диплоидных клеток человека обладают неоспоримыми преимуществами перед всеми известными видами культур - способностью сохранять в пассажах стабильными биологические и генетические характеристики, присущие клеткам здорового донора. Стандартность свойств, экономичность и возможность предварительной оценки клеток на безопасность делают диплоидные культуры приемлемым клеточным субстратом для создания МИБП. Начало нашей работы с линиями диплоидных клеток относится к 1962 году. К 1987 г. Было установлено 29 линий диплоидных клеток человека и 4 линии обезьян. В основном линии клеток человека были получены из кожи и мышц эмбриона и одна - из легких эмбриона.

В настоящее время линии наиболее перспективным клеточным субстратом при производстве вакцин считаются линии гетероплоидных клеток. Они обладают высокой пролиферативной активностью, способны расти в промышленных биореакторах, хорошо сохраняются в жидком азоте. Высокая чувствительность гетероплоидных клеток к широкому спектру вирусов позволяет использовать культуры-продуценты, приготовленные из аттестованного банка одной линии, для получения различных вакцин. Нами установлены следующие линии: 455 - из клеток селезенки взрослой зеленой мартышки, 2688 С - из семенников новорожденной зеленой мартышки, 2688 П - из почек той же обезьяны, 2688 М - из мозга того же животного, 4179 - из клеток сердца и языка эмбриона зеленой мартышки, 4647 - из клеток почек взрослой зеленой мартышки, 4921 - из кожи и мышц эмбриона зеленой мартышки, 10251 - из мозжечка зеленой мартышки, 4184 - из клеток почек эмбриона овцы, Таурус 1-3 - из почек теленка.

В результате некачественного хранения культур в криобанке часть линий была утеряна. Теперь мы располагаем 11 линиями диплоидных клеток человека, 1 линией диплоидных клеток зеленой мартышки и 12 линиями гетероплоидных клеток животных. Все оставшиеся линии были обследованы в соответствиями с рекомендациями ВОЗ к вакцинным субстратам и полностью им удовлетворяют. Две линии М-22 и 4647 прошли национальное лицензирование. Линию М-22 разрешено использовать для выпуска всех видов медицинских препаратов, а линию 4647 - для получения инактивированных вакцин.

При обследовании М-22 на стерильность (наличие грибов, бактерий, микоплазм, вирусов) получены отрицательные результаты на уровнях 10, 20, 24, 30, 33, 40 и 42 пассажей. При исследовании культуральных жидкостей и самих клеток на уровнях 10, 20, 30 и 40 пассажей в чувствительных клеточных системах, а также в реакциях гемадсорбции вирусы-контаминанты не обнаруживались. При обследовании клеток М-22 на тех же уровнях пассажей в опытах на взрослых и сосунках белых мышей, кроликах, морских свинках, куриных эмбрионах, иммунодепрессированных мышах линии СВА посторонних агентов также не установлено. Онкогенная активность клеток линии М-22 не выявлена и в опытах in vitro в органной культуре кожи куриного эмбриона.

Изучение изоферментов в клетках линии М-22 выявляет энзимограмму человека и Г6-ФДГ медленного типа. Клетки линии М-22 сохраняют жизнеспособность при длительном хранении в жидком азоте - порядка 70 %.

Линия М-22 чувствительна к заражению вакцинными штаммами А. Сэбина вируса полиомиелита. Титр вируса типа I на уровне 16 пассажа равен 7,74 lg БОЕ/мл, а на уровне 20 пассажа - 7,71, соответствующие показатели для II типа 7,60 и 7,75, а для III типа - 7,63 и 7,65. Клетки линии М-22 также чувствительны к заражению вирусами из групп ЕСНО, Коксаки, рино-. Титр вируса ЕСНО-11 составлял 10 7,5 ТЦД_50/мл, а рино - 7∙10 7 ТЦД_50/мл.

Характеристика линии 4647. Линия клеток 4647 получена в 1974 г. из почек взрослой зеленой мартышки. Линия 4647, названная по регистрационному номеру обезьяны, была использована в производстве живой полиовакцины и контрольные культуры были обследованы на отсутствие контаминантов. Сама линия 4647 установлена из контрольных культур в результате первого пассажа на 24 сутки после эксплантации. При получении линии перевиваемых клеток пассировали первичные культуры 144 обезьян, также прошедших контроль. Только одна попытка оказалась успешной, когда была получена линия 4647 (3). В 1983 году был создан банк посевных клеток на 90 пассаже с всесторонним изучением их свойств. Для изучения банка клеток были восстановлены клетки на уровне 90 пассажа и проведены 40 последовательных пассажей. После криоконсервирования жизнеспособность клеток составляла 82,5 ± 3,4 %. Индекс пролиферации на уровнях 101-123 пассажей составлял 3,2-2,9. Число популяционных удвоений колебалось от 1,3 до 1,66, время генерации - 43,6-63,2 часа. При гистологическом изучении линии на уровнях 103-127 пассажей отмечен плотный, ровный монослой, состоящий из полигональных эпителиоподобных клеток, содержащих округлые ядра, преимущественно с 2-3 ядрышками и мелкими глыбками хроматина. Отмечалась обычная локализация и содержание ДНК и РНК, мелкие глыбки гликогена, а также щелочной и кислой фосфатаз. Цитоплазматических и внутриядерных включений не выявлено. При электронномикроскопическом исследовании никаких посторонних образований не обнаружено. Аналогичные данные были получены в опытах на чувствительных культурах клеток и животных. Наличие онкогенных потенций посевного банка клеток исследовано в системе in vivo на иммуносупрессированных мышах линии СВА и в системе in vitro в органной культуре кожи куриного эмбриона. Видовая принадлежность клеток посевного банка определена с помощью биохимического исследования и кариологического анализа. Энзимограммы изоферментов глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) линии 4647 показали, что клетки имеют Г-6-ФДГ, обладающую подвижностью типа А (быстрая форма), и 5 изоформ ЛДГ, характерных для клеток зеленых мартышек. Кариологическое исследование банка было проведено на 96, 105, 115 и 130 уровнях пассажей. Установлено, что кариотип идентичен кариотипу зеленой мартышки, модальный класс представлен 120 хромосомами. Анализ 200 метафазных пластинок выявил, что количество тетраплоидных клеток составляет 44-48 %, гиперплоидных - 34-40 %, диплоидных - 10-16 %, гипоплоидных - 4-6 %. В клетках линии 4647 хорошо размножаются адено-, цитомегаловирус обезьян, пенящий вирус, вирус простого герпеса, вакцинные вирусы бешенства, клещевого энцефалита, чумы плотоядных, вакцинные штаммы вируса полиомиелеита и многие энтеровирусы, кори, паротита. Специфичность цитопатических изменений ряда вирусов была подтверждена с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител.

Таким образом, созданный банк линии 4647 полностью удовлетворяет рекомендациям ВОЗ. Отмечено, что все изученные характеристики клеток оставались стабильными в течение срока наблюдений (40 пассажей). Показано, что линия 4647 свободна от посторонних агентов, не обладает онкогенной активностью, чувствительна к заражению различными вирусами, в том числе к ряду вакцинных штаммов. С использованием клеток 4647 выпущены производственные серии вакцины против чумы плотоядных. Созданы экспериментальные серии вакцин против полиомиелита, клещевого энцефалита, диагностикумы клещевого и японского энцефалитов, лимфоцитарного хориоменингита.

Таким образом, мы владеем потентным криобанком культур клеток человека и животных, которые могут быть успешно применены в широкой вирусологической практике. Неудовлетворительное использование имеющихся линий клеток наносит, на наш взгляд, необъяснимый ущерб национальному здравоохранению и замедляет прогресс в деле разработки методов диагностики и средств для профилактики вирусных инфекций.

Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х. Линия гетероплоидных клеток 4647: изучение, применение, перспективы. - М., 1994.

Многие вирусы, поражающие человека и животных, могут в большей или меньшей степени размножаться в курином эмбрионе. Наличие плотной скорлупы защищает эмбрион от попадания микроорганизмов из внешней среды.

Метод культивирования вирусов в куриных эмбрионах используют при лабораторной диагностике вирусных инфекций, а также для изготовления вирусных вакцин и диагностических препаратов.

1.3.1. Строение куриного эмбриона

Куриный эмбрион покрыт известковой оболочкой – скорлупой, к которой изнутри примыкает скорлупная оболочка. В тупом конце яйца она раздваивается и заключает в себе воздушное пространство. Под скорлупной оболочкой находится хорионаллантоисная оболочка, в тупом конце яйца она проходит по внутренней стороне скорлупной оболочки, замыкающей воздушное пространство, эта оболочка богата кровеносными сосудами и служит эмбриону органом дыхания.

Для успешного культивирования вирусов в организме развивающихся куриных эмбрионов требуется определённый температурный режим (36 0 -38 0 ), влажность (50-70%), а также достаточная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы определённого возраста, инкубированные от 6 до 13 дней в зависимости от вида вирусов и метода заражения. Необходимо подготовить: подставку для яйца, пузырьки со спиртом и йодом, пробирку со стерильным парафином, покровные стёкла, пакетики стерильной ваты и марли, завёрнутую в бумагу стерильную посуду, стерильные шприцы, иглы, пинцеты, препаровальные иглы.

1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку

(не знаю пригодится ли)

Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху, проводят стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца.
Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.
в образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и вырезают окно в скорлупе около 1,5 см в диаметре.
Через отверстие осторожно надрывают иглой внутренний листок скорлупной оболочки и отслаивают на небольшом участке (0,5-1 см 2 ).
Производят заражение хорионаллантоисной оболочки путём нанесения на неё 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала с помощью пастеровской пипетки или шприца.
Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной плёнкой или стерильным покровным стеклом и прикрепляют расплавленным парафином.

Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное пространство было наверху, проводится стерилизация места вскрытия.
Стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного пространства.
Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку по границе. Обнажённую хорионаллантоисную оболочку подрезают вдоль края скорлупы. Через образовавшееся отверстие выливают всё содержимое яйца в чашку или лоток.
Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь её расправляют и изучают изменения, поместив чашку на тёмный фон.

Восприимчивые к изучаемым вирусам животные называются экспериментальной моделью. Взятые в опыт животные должны быть одного вида, определённого возраста и содержаться в одинаковых условиях.

Работу животными рекомендуется проводить в настольном боксе или в специальной операционной вивария. Все отходы и трупы погибших животных автоклавируют и сжигают.

При вирусологических исследованиях применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение лабораторных животных.
Индикация – неспецифическое обнаружение факта инфицирования, основано на выявлении биолог.свойств вирусов и особенностей их взаимодействия с чувствительными клетками.

Идентификация – установление вида или типа вируса.

Цитопатическое действие вируса на культуру клеток (ЦПД) – возникновение в ней видимых морфологических дегенеративных изменений (литическая инфекция);

Приобретение заражённой культурой клеток способности к гемадсорбции – к адсорбции эритроцитов на поверхности клеточного слоя;

Окончательная идентификация выделенного вируса проводится с помощью реакции нейтрализации с диагностическими вируснейтрализующими сыворотками. Определяют их родовую и видовую принадлежность.

2.1.1. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток

Основной причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки. Прекращается синтез РНК клетки-хозяина, что ведёт к подавлению синтеза белков, приводит к нарушению структуры клеточных мембран, лизосом, митохондрий. Освобождаются и активируются клеточные ферменты (лизосомальные), которые вызывают деструкцию клеточных компонентов, т.е. развитие ЦПД. При резкой дегенерации клеточный монослой гибнет.

При острой вирусной инфекции может наблюдаться образование гигантских многоядерных клеток – симпластов (или синцитиев). Симпластообразование вызывают более 20 различных вирусов, имеющих ферменты: лецитиназу, нейраминидазу, и богатых липидами (напр., парамиксовирусы).

К проявлению ЦПД вирусов относится образование внутриклеточных включений. Они образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. Образование включений может быть единственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса.

С целью обнаружения вируса в материалах от больных проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур клеток. Для заражения отбирают пробирки со сплошным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Перед заражением из пробирок отсасывают культуральную жидкость, затем вносят по 0,1 мл исследуемого материала и добавляют питательную среду до 1 мл. Каждую пробу материала вносят в 4 пробирки. Для контроля несколько пробирок оставляют незаражёнными, но также сменяют в них питательную среду. Пробирки выдерживают в термостате, обычно при 37 0 С, и ежедневно микроскопируют с целью обнаружения ЦПД (в течение недели и более).

ЦПД различных вирусов на клеточные культуры обладает определённой специфичностью. Родственные вирусы дают цитопатическую реакцию сходного типа, эффект действия отдалённых по свойствам вирусов часто различен, поэтому по типу ЦПД можно судить о семействе или роде, к которым относится исследуемый вирус:

- энтеровирусы (вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО) вызывают однородную мелкозернистую деструкцию клеток;

- аденовирусы превращают клеточный слой в скопления мелких, округлых клеток, расположенных в виде гроздьев винограда;

- парагриппозные вирусы, респираторно-синцитиальный, вирусы кори и паротита образуют симпласты.

Количественное определение вирусов в исследуемом материале проводится с помощью титрования. Для этой цели готовят 10-кратные последовательные разведения вируса, которыми заражают клеточные культуры. Титром вируса называют его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине заражённых культур. Титр вируса выражают в цитопатических дозах (ЦПД₅₀) в 1 мл. За одну ЦПД₅₀ принимают 0,1 мл вируссодержащего материала, разведённого до титра.

Для идентификации выделенного вируса по нейтрализации ЦПД культуральную жидкость смешивают с равным объёмом диагностической иммунной сыворотки (разведение сыворотки 1:5 или 1:10). После 1-2-часового контакта при комнатной температуре этой смесью (по 0,2 мл) заражают 4 пробирки с культурой клеток, из которой предварительно была удалена питательная среда; после добавления смеси в пробирки вносят по 0,8 мл свежей среды. Опыт сопровождается несколькими контролями:

1 – контроль незаражённой культуры;

2 – контроль дозы вируса – клеточные культуры заражают той же дозой вируса, что и в опыте;

3 – контроль культуры, заражённой смесью культуральной жидкости с нормально сывороткой.

Опыт учитывают через 5-7 дней и более, просматривая пробирки под малым увеличением микроскопа. В первом контроле ЦПД должно отсутствовать, во втором и третьем – обязательное проявление ЦПД. Отсутствие цитопатического эффекта в опытных пробирках указывает, что в данной пробе произошла нейтрализация вируса иммунной сывороткой, сыворотка соответствует типу выделенного вируса.

2.1.2. Реакция гемадсорбции

Гемадсорбирующие свойства имеют многие вирусы: орто- и парамиксовирусы, флавивирусы, поксвирусы. Эти же вирусы обладают спосодностью вызывать гемагглютинацию – склеивание эритроцитов. Приобретение способности к гемадсорбции связано со встраиванием в мембрану заражённых вирусом клеток вирусспецифических белков – гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности заражённых клеток. В реакции применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека 0 (I) группы. По наличию явления гемадсорбции обнаруживают присутствие вирусов в культурах клеток при латентной инфекции, когда цитопатический эффект оказывается слабо выраженным или отсутствует совершенно.

Техника постановки реакции гемадсорбции

При добавлении специфической иммунной сыворотки в пробирку с клеточной культурой, предварительно заражённой соответствующим вирусом, заражённые клетки теряют способность адсорбировать эритроциты, т.е. происходит явление задержки гемадсорбции. Вследствие специфичности этого явления реакция задержки гемадсорбции может быть использована для идентификации выделенных вирусов, а также с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующих антител в сыворотках больных.

2.1.3. Метод бляшек

Для получения бляшек клеточный монослой заражают небольшой концентрацией вируса и фиксируют адсорбировавшиеся на клетках вирионы с помощью агарового покрытия, в которое добавлен витальный краситель – нейтральный красный. ЦПД вирусов имеет очаговый характер, погибшие клетки дегенерируют, теряют способность удерживать нейтральный красный и обесцвечиваются. В результате на непрозрачном равномерно розовом фоне клеточного монослоя появляются бляшки в виде более прозрачных неокрашенных округлых пятен.

Агаровое покрытие готовят из высококачественного агара в концентрации 1-1,5% и других компонентов – солевых буферных растворов, дополнительных питательных веществ, антибиотиков. Раствор нейтрального красного входит в состав среды или его добавляют во флакон или чашку незадолго до учёта опыта. Часто вместо агара используют гель бентионита (5-6%) – это алюмосиликат природного происхождения, который биологически инертен и не токсичен для культур клеток.

Обнаружение и титрование вирусов методом бляшек

Для получения бляшек вирусов во флаконы или чашки наливают взвесь клеток в питательной среде (№ 199 или среда с гидролизатом лактальбумина). Флаконы закрывают резиновыми пробками, чашки заклеивают лейкопластырем и помещают в термостат на 5-6 дней для получения монослоя клеток, который должен быть сплошным, без признаков дегенерации. Перед заражением среду из флаконов или чашек удаляют и однослойную культуру клеток осторожно отмывают раствором Хенкса, который затем тщательно отсасывают. Заражение производят путём внесения разведённого исследуемого материала в объёме 0,1-0,25 мл и равномерного распределения этого материала по поверхности клеточного слоя с помощью покачивания. Через 30-60 минут заражённую культуру клеток заливают покровной средой. Флаконы или чашеи с застывшей средой помещают в термостат (клеточным слоем кверху) и выдерживают до образования бляшек (2-5 суток), после чего производят их подсчёт и изучение.

Разные вирусы образуют бляшки, отличающиеся по величине, форме, характеру краёв, по срокам появления и другим свойствам, что может быть использовано для предварительной идентификации вируса.

Для титрования вирусов готовят серийные разведения вируссодержащего материала и каждое из разведений вносят во флакон или чашку со слоем культуры клеток. Подсчитав образовавшиеся бляшки (с учётом разведения вируса), вычисляют титр вируса – количество вирионов в 1,0 мл исходного материала. Титр вируса, определяемый методом бляшек, принято выражать числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Метод бляшек даёт возможность провести точную идентификацию вируса с помощью диагностических специфических сывороток. При соответствии между сывороткой и вирусом происходит нейтрализация вируса и при заражении монослоя клеток такой смесью бляшки не образуются или их количество значительно снижается.

2.1.4. Цветная проба

Цветная проба (или цветная реакция) основана на разнице в цвете среды индикатором фенолрот, в которой растёт нормальная, жизнеспособная культура клеток, и среды, где находится культура, заражённая вирусом. В процессе развития нормальной культуры клеток происходит постепенное накопление кислых продуктов обмена веществ, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону. Такое изменение реакции среды говорит о наличии роста и размножения клеток. Среда с индикатором фенолрот, первоначально имевшая красный цвет (рН 7,4 – 7,6), вследствие снижения рН до 7,0 – 6,8 приобретает жёлтый цвет.

Заражение культуры клеток вирусом приводит к развитию в ней дегенеративных процессов: происходит подавление процессов метаболизма, значительно понижается гликолиз, в результате чего кислых продуктов накапливается мало, рН среды остаётся на исходном уровне и среда с индикатором фенолрот остаётся красного цвета.

С помощью цветной реакции можно определить соответствие вируса и вируснейтрализующей сыворотки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус и он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры.

Цветную пробу ставят с различными типами клеточных культур. Чаще берут первичную культуру клеток почки обезьяны или перевиваемые культуры клеток. При постановке цветной реакции необходимо учитывать, что каждая культура клеток, на которой ставят реакцию, имеет определённый уровень метаболизма. Устанавливают дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, которое должно быть взято в каждую пробирку.

При работе с культурой почечных клеток обезьяны готовят взвесь клеток густотой 100-200 тыс. в 1 мл. Из неё делают ряд возрастающих разведений в объёме 0,25 мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из красного в жёлтый н 5-6-й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза – 25 тыс. клеток в объёме 0,25 мл.

Титрование вируса методом цветной пробы

Цветную пробу ставят в пробирках, которые иногда закрывают резиновыми пробками, но чаще разобщение от атмосферного воздуха достигается наслаиванием стерильного вазелинового масла (0,6-0,8 мл) или применение алюминиевой фольги. Однотипную опытную смесь наливают в четыре пробирки.

При оценке результатов реакции учитывают два тона: жёлтый и красный (табл. 3).

При титровании вируса по цветной пробе готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала. Эти разведения вируса, взятые в объёме 0,25 мл, смешивают с 1 дозой клеток, содержащейся в таком же объёме, добавляют питательную среду по 0,25 мл и наслаивают вазелиновое масло по 0,6-0,8 мл. В реакции ставят контроли клеточной взвеси: берут 1,1/2 и ¼ дозы клеток. Пробирки помещают на 5-6 дней в термостат при 37 0 С после чего по изменению цвета учитывают реакцию.

Применение реакции гемагглютинации (РГА) для индикации и идентификации вирусов.

В процессе взаимодействия вирусов с эритроцитами различают стадии адсорбции, агглютинации и элюции. Адсорбция вирусов на эритроцитах начинается как неспецифическая, а затем переходит в специфическую вследствие сродства гемагглютининов к рецепторам эритроцитов. На одном эритроците адсорбируется множество вирусов, они образуют мостики между эритроцитами, изменяется электростатический заряд эритроцитов и в результате наступает следующая стадия взаимодействия – гемагглютинация, на которой процесс может остановиться. Некоторые вирусы способны к элюции – освобождению с поверхности эритроцитов. Элюция происходит под действием вирусных ферментов (например, нейраминидазы) на рецепторы эритроцитов. Элюированные вирусы при этом не повреждаются, эритроциты же не способны повторно адсорбировать вирус вследствие разрушения рецепторов.

При постановке РГА используют те эритроциты (птиц, животных, человека), с которыми гемагглютинирующие свойства данного вируса проявляются лучше (например, эритроциты кур). Задерживающее действие на РГА могут оказывать ингибиторы, содержащиеся в тканях, где размножался вирус, и других биологических субстратах. Для снятия ингибиторного действия вируссодержащие материалы прогревают, обрабатывают трипсином, ацетоном и др.

2.2.1. Техника постановки РГА

Если предварительно соединить вирус со специфической иммунной вируснейтрализующей сывороткой и потом добавить эритроциты, то такой инактивированный вирус теряет способность вызывать гемагглютинацию. Эта реакция получила название реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и может быть использована для окончательной идентификации неизвестного гемагглютинирующего вируса – по специфической диагностической сыворотке, а также для выявления титра неизвестных антител в сыворотке больного – по известным вирусным антигенам-диагностикумам.

Затрудняет применение РТГА наличие в сыворотках крови человека и животных неспецифических вирусных ингибиторов, которые могут вызвать неспецифическое торможение гемагглютинации. Выпускают противовирусные диагностические сыворотки, освобожденные от ингибиторов. РТГА ставят обычно на досках с лунками по методике, сходной с РГА.

1. Для культивирования вирусов используют эмбрионы в возрасте от 8 до 12 дней. Для выращивания эмбрионов оплодотворенные яйца помещают в термостат при 38° С, в котором находится посуда с водой для создания влажности. Два раза в день яйца вынимают для проветривания. Периодически яйца просматривают в овоскоп на жизнеспособность. Живые эмбрионы отличаются подвижностью, пульсацией сердца, хорошо контурируемыми сосудами. Перед заражением эмбрион осматривают в овоскоп и намечают границы воздушного мешка, а также расположение зародыша.

2. Для предотвращения инфицирования эмбриона посторонними микробами заражение проводят в асептических условиях с использованием стерильного инструмента (ставят в стаканчик со спиртом) в помещении, облученном бактерицидными лампами. Скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70 % спиртом, обжигают, смазывают 2 % йодом, вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал обрабатывают антибиотиками для удаления бактериальной флоры.

3. Существует несколько способов заражения куриного эмбриона. Чаще всего материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, на хорион-аллантоисную оболочку и в желточный мешок.

При заражении в аллантоисную полость в скорлупе над воздушной камерой проделывают небольшое отверстие с помощью ножниц или скальпеля. Туберкулиновым шприцем вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Прокол в скорлупе заливают расплавленным парафином.

При заражении на хорион-аллантоисную оболочку ножницами вскрывается скорлупа над воздушной камерой, пинцетом приподнимается подскорлуповая оболочка и шприцем на оболочку наносят 0,2-0,5 мл вируссодержащего материала при вертикальном положении эмбриона. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином.

Заражение в амниотическую полость осуществляется длинной иглой через отверстие в воздушной камере. Иглу вводят в темной комнате под контролем овоскопа. При попадании иглы в полость эмбрион сдвигается. Заражение приводит к непосредственному контакту вируса с тканями эмбриона, поэтому в данном случае вирус размножается не только в полости, но и в тканях зародыша.

При заражении в желточный мешок вируссодержащий материал вводят иглой длиной 3-4 см, которой проделывают отверстие в воздушной камере. Иглу ведут к центру с небольшим отклонением книзу при горизонтальном положении эмбриона. Отверстие в скорлупе запаивают каплей парафина.

После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37°С.

5. О репродукции вируса судят по специфическому характеру поражений на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, по РГА – реакции гемагглютинации (склеивание эритроцитов).

Особенно четко очаги поражения на хорион-аллантоисной оболочке появляются в месте заражения в виде геморрагий, белесоватых очагов (вирус кори или гриппа вызывает образование оспин на оболочке).

По РГА устанавливают присутствие вируса в аллантоисной жидкости. РГА основана на способности некоторых вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов и, изменяя их поверхность, вызывать склеивание. РГА ставят на стекле или в пробирках: готовят двукратное разведение вируссодержащего материала, добавляют 1 % взвесь отмытых куриных эритроцитов и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 30-40 минут после оседания эритроцитов в контрольной пробе, в которую вместо вируссодержащего материала добавляют аллантоисную жидкость незараженного эмбриона. При гемагглютинации образуется зернистый осадок с фестончатыми краями, а в контроле – осадок в виде диска с ровными краями. Наличие гемагглютинации в опытных пробирках при ее отсутствии в контроле указывает на присутствие вируса в исследуемой жидкости.

Как оформить тьютора для ребенка законодательно: Условием успешного процесса адаптации ребенка может стать.

После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37°С.

Основные этапы развития астрономии. Гипотеза Лапласа: С точки зрения гипотезы Лапласа, это совершенно непонятно.

Читайте также: