Посев на среду клиглера

Добавил пользователь Валентин П.
Обновлено: 18.09.2024

Семейство Enterobacteriaceae является одним из самых обширных и включает наибольшее число патогенных для человека представителей. Местом обитания всех видов энтеробактерий является кишечник, откуда они выделяются во внешнюю среду. Энтеробактерии представляют собой грамотрицательные палочки средних размеров. Спор не образуют. По типу дыхания относятся к факультативным анаэробам. Подвижны благодаря перитрихиально расположенным жгутикам или неподвижны при их отсутствии. Хорошо растут на простых питательных средах. Все представители семейства Enterobacteriaceae обладают сахаролитической активностью – ферментируют углеводы до кислоты и газа или только до кислоты. Протеолитическая активность выражена слабо. В биохимическом отношении наиболее активна Escherichia coli, являющаяся представителем нормальной микрофлоры организма человека. Наименьшей ферментативной активностью обладают Shigella dysenteriae и Salmonella typhi.

Дифференцирующие признаки энтеробактерий на среде Клиглера:

Среда Клиглера содержит:

МПА (Мясо-пептонный агар -мясопептонный бульон +агар-агар)

Индикатор рН- феноловый красный (в кислой среде желтеет)

Индикатор на Н₂S (при выделении чернеет)

Н₂S+

Сальмонелла

Принцип действия среды: ферментация глюкозы происходит только в анаэробных условиях в глубине среды (столбика) из-за ее малой концентрации. Ферментация лактозы происходит в аэробных условиях на поверхности среды (скоса). При этом цвет индикатора меняется на желтый (закисление среды). О продукции сероводорода узнаем по почернению среды.

1.Эшерихии.

Таксономия и классификация

Царство: Procaryota; Отдел: Gracilicutes; Семейство:Enterobacteriaceae; Род: Esherichia; Вид: Esherichia coli.

Морфология и тинкториальные свойства

Эшерихии палочки средних размеров. Грамотрицательны, большинство подвижны благодаря перитрихиально расположенным жгутикам, но есть и неподвижные варианты. Спор не образуют. Некоторые штаммы имеют капсулу.

Биологические свойства

Факультативные анаэробы. Растут при температуре от 10° до 46°С, оптимальная температура 35 - 37°С. Хорошо растут на простых питательных средах образуя колонии средних размеров, гладкие, влажные, блестящие, с ровным краем. На жидких средах вызывают равномерное помутнение, иногда с осадком или пленкой. В окружающей среде эшерихии устойчивы. При 60°С погибают в течение 15 мин. В воде, почве сохраняют жизнеспособность в течение нескольких месяцев. Прямой солнечный свет вызывает гибель через несколько минут. Чувствительны к действию дезинфицирующих веществ.

Биохимические свойства

Эшерихии высоко активны – ферментируют углеводы, в т.ч. лактозу, до кислоты и газа. Протеолитическая активность выражена слабо, могут продуцировать индол. Большинство эшерихий лактозоположительны поэтому на среде Эндо (МПА + лактоза + фуксин) образуют темно-красные колонии с металлическим блеском, не ферментирующие лактозу эшерихии, растут в виде бесцветных колоний.

Антигенная структура

Сложная: соматический О-антиген, капсульный К-антиген и жгутиковый Н-антиген. О-антиген (171 разновидность) определяет серологическую группу. Поверхностный К-антиген представлен 3 вариантами – А, В и L. Они отличаются друг от друга по термоустойчивости. Самым термостабильным является А-антиген – он выдерживает кипячение в течение двух часов. В-антиген выдерживает воздействие температуры 60°С в течение часа. L-антиген разрушается при нагревании до 60°С. К-антиген располагается более поверхностно, чем О-антиген, поэтому он может препятствовать агглютинации О-сыворотками. В этом случае О-антиген можно выявить только после разрушения К-антигена кипячением в течение двух часов. Типовой специфичностью обладает Н-антиген, по которому эшерихии делятся на серологические варианты (около 60).

Патогенность

По патогенности вид E. coli не является однородным. Различают:

непатогенные (резидентные) комменсалы, пожизненно колонизирующие толстый кишечник;

условно-патогенные – вызывают внекишечные поражения (цистит, сепсис); такие заболевания возникают, как правило, эндогенно за счет эшерихий, колонизирующих кишечник;

патогенные (диареегенные) эшерихии – вызывают острые кишечные инфекции (ОКИ), которые имеют экзогенное происхождение.

Условно-патогенные эшерихии входят в состав нормальной микрофлоры кишечника. Являются санитарно-показательными микроорганизмами (присутствие кишечной палочки в воде, почве, пищевых продуктах, предметах обихода свидетельствует о их фекальном загрязнении). Условно-патогенные эшерихии способны вызывать заболевания при проникновении в ткани вне пищеварительного тракта - в мочевыводящие и желчные пути, легкие, брюшину, мозговые оболочки, где возникает гнойно-воспалительный процесс, который нередко развивается на фоне иммунодефицита.

Патогенные E. сoli – возбудители ОКИ, получили название диареегенных. Они подразделяются на 4 основные категории:

энтеротоксигенные E. сoli (ETEC);

Энтероинвазивные эшерихии (EIEC). Серогруппы: О28ас, О29, О124, О136, О143, О144, О152, О164, О167. Способны внедряться и размножаться в клетках эпителия нижнего отдела подвздошной и толстой кишки. Являются возбудителями дизентериеподобных заболеваний, характеризующихся непродолжительной водянистой диареей, развитием колитического синдрома, лихорадкой, токсикозом. В стуле возможна примесь крови, слизи, полиморфноядерных лейкоцитов. Обычно болеют дети в возрасте от 1,5 до 2 лет, но могут болеть и подростки, и взрослые. Сезонность летне-осенняя. Вспышки пищевые, водные. Заболевания нередко регистрируются как госпитальная инфекция, при этом доминирует E. сoli О124.

Энтеропатогенные эшерихии (EPEC). Эта группа эшерихий включает 9 серогрупп класса 1: О55, О86, О111, О119, О125, О126, О127, О128аb, О142 и четыре серогруппы класса 2: О18, О44, О112, О114. Вирулентность этой группы эшерихий связана с белком наружной мембраны, получившим название интимин, его синтез детерминирован хромосомным геном, а также белком, синтез которого контролируется плазмидой 60 мДа. Некоторые серовары продуцируют шигаподобные токсины. ЕРЕС обладают способностью размножаться на поверхности эпителия тонкого кишечника, что приводит к разрушению микроворсинок и повреждению апикальной поверхности эпителия. Заболевание характеризуется продолжительной водянистой диареей, рвотой, лихорадкой, симптомами обезвоживания. Часто имеет место тяжелое, пролонгированное течение. В стуле обнаруживается примесь слизи. Инфекция передается преимущественно контактно-бытовым путем. Преимущественно болеют дети в возрасте до двух лет. Сезонность не выражена. Вспышки бытовые, редко пищевые. Часто регистрируются как внутрибольничные инфекции в отделениях для новорожденных и грудных детей, находящихся на искусственном вскармливании.

Энтерогеморрагические эшерихии (EHEC). Серогруппы: О26, О111, О145, О157. Наибольшее эпидемиологическое значение имеет E. сoli серовара О157:Н.

ЕНЕС способны к адгезии на поверхности клеток эпителия толстой кишки. Адгезия обусловлена пилями, детерминированными плазмидой размером 60 мДа. Эта плазмида, кроме этого, детерминирует синтез гемолизина, способствующего нарушению барьерной функции кишечника. Развитие геморрагического колита обусловлено способностью эшерихий данной группы продуцировать шигаподобные токсины (их синтез контролируется конвертирующими фагами). Поражаются слепая, восходящая и поперечная толстая кишка. Клинически заболевание проявляется колитическим синдромом, отсутствием лихорадки. В испражнениях наблюдается обилие крови, но без полиморфноядерных лейкоцитов. Около 5% больных погибает, у 12 – 30% возникают тяжелые осложнения, включая почечную недостаточность, гипертонию, поражение центральной нервной системы. Сезонность летне-осенняя. Поражаются все возрастные группы за исключением грудных детей.

Экология и распространение

Эпидемиология, патогенез и клиника заболевания (особенности)

Гастроэнтерит новорожденных - тяжелое, часто смертельное заболевание. Диарея взрослых - от легких форм, сопровождающихся жидким стулом, недомоганием, до тяжелой холероподобной формы болезни. Эти заболевания встречаются повсеместно, однако чаще среди некачественно питающихся групп населения. Источник инфекции человек, больной или носитель. Механизм передачи фекально-оральный, пути передачи- пищевой, водный, бытовой. Аутоинфекции. Инфекция мочевого тракта. Е. coli - самый распространенный возбудитель воспаления мочевого пузыря (цистит), реже почек (пиелонефрит). Инфекция преимущественно восходящая - из уретры в мочевой пузырь и почечные лоханки. Штаммы, вызывающие эти заболевания, отличаются по некоторым свойствам, например, по способности образовывать фимбрии, которые служат у них фактором адгезии. Бактериемия — тип генерализованного процесса, вызываемого E.coli. Иногда этот тип инфекции встречается при внутрибольничном заражении. Бактериемия может исходить из абсцессов в брюшной полости, мозге, костях.

Лабораторная диагностика

Основной метод диагностики – бактериологический. Исследуемым материалом может служить гнойное отделяемое раны, моча, кровь, при острых кишечных инфекциях – фекалии. Материал засевают на среду Эндо. По морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам патогенные и непатогенные эшерихии не отличаются друг от друга, поэтому отбор подозрительных колоний проводят по антигенной структуре: на стекле ставят реакцию агглютинации с поливалентными адсорбированными коли-сыворотками и материалом из колоний. Если на чашке вырастают колонии одного типа (на среде Эндо – малиново-красные, с металлическим блеском), агглютинируют не менее 10 колоний. Если обнаруживаются колонии разных типов (малиново-красные без металлического блеска, темно-розовые и т.п.), то испытывают с помощью реакции агглютинации по 5 колоний каждого типа. Чистую культуру выделяют из колоний, давших положительную реакцию агглютинации с поливалентной коли-сывороткой. Идентификацию выделенных культур проводят путем изучения ферментативной активности и антигенной структуры. Определяют серологическую группу с живой и гретой культурой и О- и К-сыворотками. Для выявления О-антигена культуру эшерихий кипятят на водяной бане в течение 1 – 2 часов, что приводит к разрушению К-антигена.

Специфическая профилактика и терапия

Специфическая профилактика не разработана. Основу неспецифической профилактики составляют санитарно-гигиенические и противоэпидемические мероприятия

1. Среда Клиглера. Среда Клиглера предназначена для дифференциации энтеробактерий по их способности ферментировать глюкозу, лактозу и образовывать сероводород.

Состав:
Мясная вода — 1000,0 мл
Пептон — 20,0 г
Лактоза —10,0 г
Глюкоза — 1,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Натрия сульфит (Na₂SO₃*7H₂O) — 0,4 г
Натрия тиосульфат (Na₂S₂O₃*5H₂O) — 0,08 г
Железа II сульфат (Fe₂SO₄*7H₂O) — 0,5 г
Агар — 20,0 г
Феноловый красный (1%-ный раствор в 50%-ном этиловом спирте) — 12,0 мл
pH 7,4±0,2

В мясную воду добавляют пептон, соли натрия, агар. Кипятят до полного растворения, устанавливают pH 7,8, снова кипятят. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем добавляют остальные ингредиенты. Сульфат железа предварительно растворяют в небольшом количестве воды. Готовую среду разливают в пробирки по 6,0-7,0 мл. Стерилизуют при 112°С 30 мин. Скашивают, оставляя столбик высотой 2,0-2,5 см.

Расщепление сахаров, сопровождающееся образованием кислот, устанавливают при помощи индикатора фенолового красного (в кислой среде желтеет). Рост микроорганизмов начинается с утилизации сахаров. В первые 5-6 ч инкубации штаммы, расщепляющие только глюкозу, но не лактозу, утилизируют содержащуюся в невысокой концентрации (0,1%) глюкозу в скошенной части агара, изменяя цвет косяка с красноватого на желтый.

Такие же изменения среды вызывают штаммы, расщепляющие и глюкозу, и сахарозу.

Однако на вторые сутки (через 40-48 ч) инкубации посевов будет наблюдаться щелочение среды с покраснением скошенной ее части за счет расщепления пептонов, а следовательно, учет ферментации сахаров надо производить не позднее 24 ч.

При ферментации углеводов конечными продуктами метаболизма могут быть H₂ и CO₂. В этих случаях в среде отмечаются трещины и разрывы, при скоплении газа на дне пробирки столбик агара приподнимается.

Некоторые бактерии продуцируют энзим тиосульфатредуктазу, способную из неорганических соединений серы образовывать не видимый глазу газообразный сероводород. Для его обнаружения в среду Клиглера вводят железа II сульфат. Реакция образования сероводорода протекает в два этапа:

— в начале в кислой среде, в анаэробных условиях под действием микробной тиосульфатредуктазы тиосульфат восстанавливается в тиосульфит с выделением бесцветного водорода;

— введенный в среду железа сульфат (FeSO₄) вступает в реакцию с сероводородом (H₂S), образуя сернистое железо (FeS) в виде нерастворимого преципитата черного цвета, в результате чего столбик среды приобретает черный цвет.

2. Трехсахарный агар с солями железа (TSI) в модификации НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова. Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по признаку ферментации углеводов..

Принцип действия среды тот же, что для агара Клиглера.

Состав:
Вода мясная — 1000,0 мл
Экстракт дрожжевой жидкий — 100,0 мл
Экстракт дрожжевой (по сухой массе) — 3,0 г
Пептон — 20,0 г
Натрия хлорид — 3,5 г
Агар - 15,0 г
Железа II сульфат (перекристаллизованный) FeSO₄ — 0,2 г
Натрия тиосульфат (Na₂S₂O₃) — 0,3 г
Глюкоза — 1,0 г
Лактоза — 10,0 г
Сахароза — 10,0 г
Феноловый красный (0,2% водный раствор) — 12,0 г
pH 7,0±0,1

Готовят основу среды. К мясной воде добавляют дрожжевой экстракт, пептон, натрия хлорид и агар. Смесь подогревают до расплавления агара, устанавливают pH. Среду фильтруют, разливают в матрицы или колбы по 0,5 л, стерилизуют при 121°С 30 мин.

К стерильной основе добавляют остальные ингредиенты, хорошо перемешивая, разливают асептически в стерильные пробирки по 6-7 мл, стерилизуют текучим паром или при 112°С 30 мин. Скашивают в горячем виде, оставляя столбик высотой 2,0-2,5 см.

Посев производят так же, как на среду Клиглера.

Принцип действия трехсахарного агара с железом (TSI) аналогичен механизму действия среды Клиглера. Роль сахарозы в среде заключается в том, что она позволяет распознавать и исключать некоторые ферментирующие сахарозу и не ферментирующие лактозу штаммы из групп Proteus и Escherichia.

Hafnia и Providencia не ферментируют лактозу или ферментируют ее крайне медленно, в то же время они быстро ферментируют сахарозу, что отличает их от групп Salmonella и Shigella.

В случаях с неявными результатами делают дополнительно посевы на среды Гисса с лактозой и сахарозой.

3. Трехсахарный агар с железом, HiMedia, TSI, Triple Sugar Iron Agar. Среда предназначена для дифференцирования энтеробактерий по способности расщеплять декстрозу, лактозу, сахарозу и продуцировать сероводород. Среда может быть использована для проведения ONPG-теста.

Состав, г/л:
Пептон — 10,0
Триптон — 10,0
Экстракт дрожжевой — 3,0
Экстракт говяжий — 3,0
Лактоза — 10,0
Сахароза — 10,0
Декстроза — 1,0
Железа сульфат — 0,2
Натрия хлорид — 5,0
Натрия тиосульфат — 0,3
Феноловый красный — 0,02
Агар — 12,0
pH 7,4±0,2

Навеску среды 65,0 г растворяют при нагревании в 1000,0 мл дистиллированной воды. Среду доводят до кипения. Устанавливают pH. Разливают в пробирки по 7,0 мл.

Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. После стерилизации среду скашивают с образованием столбика 2,0-2,5 см. Готовая к употреблению среда имеет розово-красный цвет.

4. Среда Ресселя (двухсахарный агар), сухая. Предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности ферментировать 2 сахара.

Состав, г/л:
Гидролизат казеина панкреатический — 8,7
Натрия хлорид — 4,3
Лактоза — 10,0
Глюкоза — 1,0
Бромтимоловый синий — 0,03
Агар — 9,0
pH 7,2±0,2

Навеску среды 33,0 г растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды и нагревают. При необходимости устанавливают pH. Затем фильтруют и разливают в пробирки по 6-7 мл. Стерилизуют при 121°С в течение 20 мин. После стерилизации среду скашивают, оставляя внизу столбик высотой 2,0-2,5 см. Готовая к употреблению среда имеет зеленовато-голубой цвет.

Среду засевают непосредственно материалом из колонии уколом и по поверхности скоса. Энтеробактерии, расщепляющие оба сахара, вызывают равномерное изменение окраски всей среды (в желтый цвет) за счет обильного кислотообразования. Бактерии, расщепляющие только глюкозу, окрашивают среду в столбике, а участок скоса сохраняет исходный голубой цвет. Газообразование учитывается по наличию пузырей и разрывов в толще агара.

При самостоятельном изготовлении среды в лабораториях в качестве основы используется 1%-ной МПА. Возможна замена сахарозы на лактозу (1%).

5. Трехсахарный агар с мочевиной (среда И.С.Олькеницкого). Среда И.С.Олькеницкого предназначена для дифференциации энтеробактерий по их способности сбраживать углеводы: лактозу, глюкозу, сахарозу — и ферментировать мочевину с выделением аммиака.

Состав:
Агар питательный сухой — 25,0 г
Лактоза — 10,0 г
Сахароза — 10,0 г
Глюкоза - 1,0 г
Аммония железа (II) сульфат [(NH₄)₂FeSO₄*12H₂O] — 0,2 г
Натрий тиосульфат Na₂S₂O₃*5H₂O — 0,3 г
Мочевина — 10,0 г
Феноловый красный (0,4%-ный водный раствор) — 4,0 мл
Вода дистиллированная — 1000,0 мл
pH 7,3±0,1

Соли предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Углеводы и мочевину растворяют таким же образом при подогреве на водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в остальном объеме воды при нагревании на огне и постоянном перемешивании. Затем все ингредиенты перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают pH.

Добавляют индикатор, хорошо перемешивают с расплавленным агаром, разливают в пробирки по 6,0-7,0 мл. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд 20 мин или при 110°С в течение 20 мин. Скашивают, оставляя столбик 2,0-2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

Реакции ферментации углеводов и образования сероводорода те же, что и на среде Клиглера. Присутствие в среде мочевины позволяет определить у культуры наличие уреазы.

Расщепление мочевины завершается образованием аммиака, что сопровождается резким смещением pH среды в щелочную зону (pH 8,0-8,2), в результате чего столбик и скошенная часть агара приобретают красный цвет, поэтому при исследовании уреазоположительных штаммов анализ ферментации углеводов невозможен. Для определения их сахаролитической активности требуются специальные среды (например, среды Гисса).

6. Среды для теста на органические кислоты, (D-, L-, I-тартрат, мукат, цитрат).

Среды предназначены для дифференциации сальмонелл и близкородственных микроорганизмов.

Состав, г/л:
Основа сред:
Пептон — 10,0
Бромтимоловый синий — 0,024
Варианты ингредиентов:
D-тартрат (правовращающая соль) — 10,0
или L-тартрат (левовращающая соль) — 5,0
или I (мезо)-тартрат (оптически инертная соль) — 5,0 или мукат (слизевая кислота) — 10,0
или натрия цитрат (нейтральный) — 10,0
pH 7,4+0,1

Пептон и индикатор растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды, добавляют 1% соответствующей соли винной кислоты (D-, L-, 1-тартрат, натриевая или калийная соль). Устанавливают pH при помощи 10%-ного раствора NaOH. Разливают по 3,0-5,0 мл в пробирки. Стерилизуют при 112°С в течение 20 мин. Готовая к употреблению среда — сине-зеленого цвета.

Основу среды для определения утилизации муката (слизевой кислоты) вначале стерилизуют при том же режиме. Затем в горячую среду асептически вносят стерильный раствор слизевой кислоты (до 1%). Устанавливают pH посредством 10%-ного раствора NaOH. Разливают по 3,0-4,0 мл в стерильные пробирки (допускается стерилизация среды со слизевой кислотой при 112°С в течение 10 мин). Необходим строгий контроль стерильности готовой среды.

При положительном результате среды приобретают желто-зеленый цвет.

7. Среда с малонатом натрия (модификация Ewing), HiMedia, Malonate Broth, Ewing modified.

Среды предназначены для дифференциации энтеробактерий по признаку утилизации соли малоновой кислоты.

Состав, г/л:
Экстракт дрожжевой — 1,0
Аммония сульфат — 2,0
Калия дигидрофосфат — 0,4
Калия гидрофосфат — 0,6
Натрия хлорид — 2,0
Натрия малонат — 3,0
Глюкоза — 0,25
Бромтимоловый синий — 0,025
pH 6,7±0,2

Навеску среды 9,28 г растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды, доводят до кипения, при необходимости фильтруют. Устанавливают pH. Среду разливают в пробирки по 2,0-3,0 мл. Стерилизуют при 112°С 30 мин или при 121°С 15 мин, скашивают. Готовая среда имеет светло-зеленый цвет. При положительном результате среда становится ярко-синей.

8. Среда Козера. Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности утилизировать цитрат.

Состав, г/л:
Натрий аммония фосфат (NH₄NaHPO₄) — 1,5
Калия фосфат однозамещенный KH₂PO₄ — 1,0
Магния сульфат (MgSO₄*7H₂O) — 0,2
Натрия цитрат — 3,0
pH 6,7±0,2

Навеску среды 5,7 г растворяют при нагревании в 1000,0 мл дистиллированной воды, разливают в пробирки по 3,0-5,0 мл. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Готовая к употреблению среда бесцветна, прозрачна.

Культуры, не утилизирующие цитрат, на среде Козера не растут, и она остается прозрачной.

Читайте также: