Питательные среды для первичного посева

Добавил пользователь Валентин П.
Обновлено: 18.09.2024

Питательные среды готовят из продуктов животного или раст происхождения. Состав сред определяется метаболическими потребностями той или иной группы бактерий.

Питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

содержать основные питательные вещества в легкоусвояемой форме
быть влажными
быть изотоничными
быть нетоксичными (для исследуемых микробов)
быть стерильными
иметь определённую вязкость
иметь оптимальный показатель рН
иметь оптимальный окислительно-восстановительный (редокс) потенциал
обладать буферными свойствами
по возможности быть прозрачными.

Питательные среды делят по консистенции на:

Питательные среды делят по составу на:

Питательные среды делят по целевому назначению:

основные
консервирующие
транспортные
накопительные
селективные
диференциально-диагностические
специальные — обогащённые (кровяные, сыворотные и т.д.)
среды для хранения.
среды для культивирования анаэробов – особые среды

Питательные среды. Классификация.

Основные питательные среды (МПБ,МПА) – простые по составу и применяются для культивирования большинства непроходимых бактерий. Содержат: мясной экстрат, пептон, хлорид натрия (МПА дополнительно содержит агар-агар). Жидкая среда (МПБ), плотная среда(МПА).

Обогащённые питательные среды можно приготовить на основе простых, включив в их состав кровь, гемин, сыворотку, асцитическую жидкость и др. Такие среды используют для культивирования бактерий со сложными пита потребностями (прихотливых микроорганизмов). Жидкая среда (сахарный бульон, сывороточный бульон, асцитический бульон), плотная среда (сахарный агар, сывороточный агар, кровяной агар)

Накопительные питательные среды – жидкие питательные среды,которые применяют при необходимости накопить в них бактерии определённой группы в результате их преимущественного размножения по сравнению с сопутствующими микробами. Состав этих сред подбирают таким образом, чтобы рост сопутствующей флоры частично или полностью был задержан. Жидкие среды (селенитовый бульон). Плотной среды нет.

Селективные питательные среды – используют для избирательного культивирования микроорганизмов определённых видов при подавлении роста других микроорганизмов. Такой эффект достигается при добавлении различных ингибиторов роста микробов, изменении показателя рН, состава питательных веществ в среде и прочего. Жидкая среда (щелочная пептонная вода, желчный бульон, среды с антибиотиками). Плотная среда (солевой агар, желчно-солевой агар, среды с антибиотиками)

Дифференциально-диагностические питательные среды позволяют различить бактерии по их росту, биохимической активности и другими признаками. В состав этих сред, кроме питательных веществ, обычно включают субстрат, по отношению к которому дифференцируются бактерии и индикатор.

В результате культивирования микробы, ферментирующие субстрат, способствуют накоплению продуктов расщепления, сдвигу рН, редокс-потенциала среды, что сопровождается окрашиванием среды и собственных колоний в цвет индикатора. К дифференциально-диагностическим средам относят также комбинированные полиуглеводные среды Рассела, Клигера, Олькеницкого, трехсахарный железосодержащий агар и др.)

Дифференциально-диагностические среды обычно являются плотными, реже полужидкими, в своём составе они имеют несколько ферментируемых субстратов и индикаторных систем, что позволяет использовать их не только для накопления чистой культуры в процессе её выделения, но и одновременно проводить первичную идентификацию культуры по ряду фенотипических признаков. Жидкие среды (среды Гисса). Плотные среды (агары Эндо, Левина, Олькеницкого, среда Гисса (полужидкая).

Транспортные и консервирующие питательные среды – применяют для временного сохранения микроорганизмов после взятия исследуемого материала и при транспортировке его в лабораторию. Обычно эти среды содержат только буферные и солевые растворы. Иногда добавляют агар-агар, активированный уголь, твин-80 – для придания полужидкой консистенции и нейтрализации токсических воздействий. Они не предназначены для культивирования микроорганизмов.

К ним относятся: среда Амиеса – полужидкий агар с активированным углём, глюкозо-дрожжевая среда, СКС и др.

Среды для хранения культур – предназначены для длительного сохранения чистых культур микроорганизмов в условиях лаборатории. Основным требованием для них является способность длительного поддержания жизнеспособности без изменения основных свойств культур. Одним из важных моментов в работе по выделению возбудителя из исследуемого объекта является взятие,хранение и транспортировка материала. Жидкая среда (глицерин – для хранения при 20С). Плотная среда – среда Дорсе.

Питательная среда – жидкий, полужидкий или плотный субстрат, используемый для выращивания микроорганизмов (грибов, бактерий и прочее) в лабораторных и производственных условиях [4] .

Содержание:

При культивировании микроорганизмов важно создать оптимальные условия для их роста. Одним из основных факторов успешного культивирования является состав и свойства питательной среды. Универсальной питательной среды, пригодной для роста и развития всех без исключения микроорганизмов не существует, поскольку конструктивные и энергетические процессы микробов различны [3] [1] .

Питательные среды

1. Жидкая питательная среда (мясо-пептонный бульон или МПБ) [2] .; 2. Полужидкая среда (мясо-пептонный желатин или МПЖ) [2] .; 3. Плотная питательная среда (мясо-пептонный агар или МПА) [2]

Виды питательных сред

По составу питательные среды делят на:

Синтетические – представляют собой водные растворы химически чистых соединений в установленных дозировках. Состав таких питательных сред полностью известен, но используются они для немногих видов нетребовательных к питанию микроорганизмов [1] .
Натуральные или естественные – состоят из продуктов животного или растительного происхождения. Химический состав таких сред сложен и точно не определен. К ним относят мясопептонный бульон и агар, солодовое сусло, сусло-агар, обезжиренное и гидролизованное молоко, отвары овощей [1] .

По целевому назначению питательные среды делят на:

Основные – применяются для выращивания многих бактерий. К ним относят мясопептонный бульон (МПБ), триптические гидролизаты рыбных, мясных продуктов, казеина. Основные среды служат для приготовления сложных питательных сред. К ним добавляют молоко, сахар, кровь и прочие ингредиенты [1] .
Селективные (избирательные) – предназначены для выделения и накопления микроорганизмов определенных видов или групп из объектов, содержащих разнообразную микрофлору. Сопутствующие микробы или совсем не растут на селективных средах или развитие их сильно подавляется. Разработка таких питательных сред основывается на биологических особенностях конкретных микроорганизмов, отличающих их от многих других [1] .
Дифференциально-диагностические – позволяют быстро устанавливать и отличать группы микроорганизмов друг от друга. Их состав подбирается с расчетом четкого выявления характерных свойств конкретного вида. Во многих случаях это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов, окрашивающих колонии определяемых микробов в конкретные цвета [1] .

По физическому состоянию питательные среды делят на:

Жидкие (бульоны) – используют для накопления биомассы микробов, продуктов их метаболизма, а так же для выявления физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов [1] .
Полужидкие – питательные среды, содержащие от 0,08 до 0,7% агара [1] .
Плотные – готовятся из жидких питательных сред, путем добавления желирующих веществ – агара или желатина (1,5–2,0%). Данные вещества при растворении в горячей воде формируют коллоидный раствор, дающий при охлаждении плотный гель (студень). Студеобразные среды возможно расплавить при помощи нагревания. Плотные среды используют для выделения чистых культур микроорганизмов: в диагностических целях, для количественного учета микроорганизмов, определения протеолитической и антагонистической активности [1] .
Сухие – выпускаются специализированными предприятиями, используются в микробиологических целях. Перед использованием в них добавляют воду и стерилизуют [1] .

Культура бактерии Xanthomonas axonopodis

Селективная питательная среда [5]

Требование к питательным средам

Для культивирования микроорганизмов используют различные по составу питательные среды. Но все они должны соответствовать ряду общих требований:

содержать полный набор веществ необходимых для питания, выращиваемого микроорганизма, в легко усвояемой форме;
обладать оптимальной влажностью, вязкостью, кислотностью среды (pH);
быть изотоничными ( с осмотическим давлением равным осмотическому давлению внутри клетки);
по возможности – быть прозрачными [3][1] .

Основные компоненты любой питательной среды – источники азота и углерода. Их количественное отношение является определяющей характеристикой большинства сред [3] .

Автотрофные микробы требовательны к наличию углекислого газа, поскольку его концентрация в воздухе составляет только 0,03 %. Для обеспечения питательных сред углекислым газом вносят обычно карбонат кальция (СаСО₃), иногда – гидрокарбонат натрия (NaHCO₃), либо другие карбонаты. В некоторых случаях через среду продувают воздух, искусственно обогащенный углекислым газом до 1–5% [3] .

Гетеротрофные организмы успешно развиваются на средах, содержащих источники углерода в виде органических соединений. В зависимости от индивидуальных особенностей гетеротрофные микроорганизмы используют разнообразные органические соединения – спирты, органические кислоты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения. Обычно в лабораторной практике в качестве источника углерода применяют глюкозу, поскольку именно это соединение углерода легче всего утилизируется микробами [3] .

Потребности в источниках азота удовлетворяются азотосодержащими соединениями, с разной степенью восстановленности азота. В основном, это соли аммония, вносимые в питательную среду в форме сульфатов и хлоридов. При использовании этих веществ необходимо учитывать их высокую физиологическую кислотность, влияющую на кислотность среды и развитие микроорганизмов. Кроме того, потребность в азоте удовлетворяется нитратами. Нитриты используются очень редко, поскольку токсичны для многих микроорганизмов [3] .

Не маловажными для построения веществ микробной клетки являются соединения фосфора, серы, калия, магния, кальция и других элементов, которые так же должны содержаться в питательной среде в доступной форме. Их потребность удовлетворяется за счет минеральных солей [3] .

Потребность в сере удовлетворяются сульфатами. В фосфоре – солями фосфорной кислоты. Все необходимые металлы и прочие элементы – в форме катионов или анионов неорганических солей. В частности, источник магния – сульфат магния (MgSO₄), натрия – хлорид натрия или поваренная соль (NaCl), кальция – хлорид кальция (CaCl₂) или карбонат кальция (CaCO₃).

Для нормального развития микробов, в том числе бактерий, необходимы так называемые факторы роста (аминокислоты, азотистые основания, витамины, жирные кислоты, железоприны и многие другие соединения). Их добавляют в питательные среды в значительно меньшем количестве, чем макроэлементы [3] .

Потребность в нескольких аминокислотах удовлетворяют, добавляя гидролизат белка. Для его получения используют белки животного или растительного происхождения. В первом случае это мясо, рыба, желатин, казеин. Во втором – семена сои, подсолнечника, кукурузы. Источником аминокислот могут служить клетки микроорганизмов – дрожжи, водоросли, бактерии [3] .

Гидролиз проводится с использованием протеолитических ферментов, кипячением крепких щелочей или минеральных кислот. Некоторые натуральные вещества (дрожжевой или кукурузный экстракт) содержат несколько факторов роста (минеральные соли, витамины, аминокислоты) [3] .

Техника посевов микроорганизмов на питательные среды

Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериологические петли, иглы, шпатели, пипетки. Посевы всегда проводят около пламени горелки. Около работающего с чистой культурой нельзя делать резких движений, ходить, кашлять и т.п., так как движение воздуха увеличивает опасность попадания посторонних микроорганизмов в пробирку с культурой. Поэтому посевы и пересевы микроорганизмов рекомендуется проводить в боксе.

Рис. 19. Правила разливания питательной среды в чашки Петри

Посев в жидкую питательную среду. Посев производят петлей или градуированной пипеткой. Посевной материал бактериологической петлей осторожно вносят в пробирку и легко встряхивают в верхнем слое питательной среды или растирают по стенке, смывая его жидкой средой.

Стерильную пипетку фламбируют (обжигают) в пламени горелки, опускают в пробирку с культурой, отбирают определенное количество материала и переносят его в пробирку со свежей питательной средой, выпуская жидкость по стенке пробирки, или вносят пипетку вглубь среды и выдувают содержащийся в ней материал.

Посев штрихом в пробирку со скошенным агаром (рис.22). Пробирку с культурой и пробирку со скошенным питательным агаром берут в левую руку и держат в наклонном положении. В правую руку берут бактериологическую иглу и прокаливают ее в пламени спиртовки до покраснения, затем проносят сквозь пламя иглодержатель. Мизинцем правой руки вынимают пробки из обеих пробирок, обжигают края пробирок. Петлю вводят в пробирку с культурой, охлаждают ее о края пробирки и осторожно снимают небольшое количество микробной культуры. Петлю с посевным материалом быстро переносят в пробирку со стерильной средой и опускают почти до дна, где скапливается небольшое количество конденсационной влаги. Слегка касаясь агара, проводят зигзагообразную линию, при этом петлю не отрывают от поверхности питательной среды. После посева петлю вынимают из пробирки и обжигают вместе с остатками посевного материала.

Рис. 24. Посев на агар в чашки Петри шпателем Дригальского

Глубинный посев в чашку Петри. Определенное количество подготовленного к посеву исследуемого материала (1,0 или 0,1 см 3 ) вносят пипеткой в пустую чашку Петри. Из пробирки или колбы с расплавленной и остуженной до 45 °С питательной средой вынимают пробку, обжигают края в пламени горелки и, слегка приоткрыв крышку, выливают на дно чашки.

Пробирки и чашки с посевами помещают в термостат с температурой, оптимальной для конкретного микроорганизма. Как правило, мезофильные бактерии выращивают при температуре 37±1 °С, термофильные бактерии – при 40–55 °С, дрожжи и плесени – при 30±1 °С.
Культивирование и рост микроорганизмов
Выращивание микроорганизмов на питательных средах называется культивированием, а развившиеся в таких средах микроорганизмы – культурой. При культивировании происходит рост культуры – физиологический процесс, в результате которого увеличивается биомасса – масса клеточного вещества данного микроорганизма.

Чистой культурой микроорганизма называют культуру, которая представлена потомством одной клетки. Естественным путем получить чистую культуру почти невозможно, поэтому ее получают искусственно. Для выделения чистой культуры используют плотные питательные среды, на которых каждая клетка вырастает в виде изолированной колонии – популяции микроорганизмов одного вида.

Перед выделением чистой культуры из какого-либо пищевого продукта или природного субстрата (например: почвы, воды), в котором данный микроорганизм находится в небольших количествах, вначале получают накопительные культуры, проводя культивирование в элективных условиях.

Накопительные культуры состоят преимущественно из клеток микроорганизмов одного вида. Элективные (накопительные) условия – условия, способствующие развитию одной культуры и ограничивающие развитие сопутствующих микроорганизмов. Создать накопительные условия можно путем использования накопительных сред. Примером элективных условий может быть повышенная температура (для выделения термоустойчивых форм бактерий), повышенная кислотность, повышенная концентрация соли и т.д.

Инкубация – культивирование микроорганизмов при определенной температуре.

Хранят чистые культуры обычно на плотных питательных средах в пробирках. При этом постоянно необходимо делать пересевы на свежую питательную среду.

К другим способам хранения чистых культур относятся сохранение их на накопительной среде под слоем вазелинового масла и хранение в лиофилизованном состоянии (сушка под вакуумом замороженных клеток микроорганизмов).

В пищевой промышленности применяют чистые культуры дрожжей, молочнокислых, уксуснокислых, пропионовокислых бактерий, обладающих ценными свойствами для производства. В последнее время находят успешное применение многокомпонентные чистые культуры, состоящие из двух и более видов микроорганизмов.

Работа по получению и поддержанию чистых культур промышленных микроорганизмов осуществляется в научно-исследовательских лабораториях. Там они выделяются из различных субстратов, изучаются, и наиболее продуктивные, пригодные для производства, хранятся в коллекции музея чистых культур, откуда рассылаются отраслевыми научно-исследовательскими институтами на предприятия. В заводской лаборатории микробиолог подготавливает культуру для производственного цикла, проверяет ее биологическую чистоту, активность.

Способ культивирования зависит от конечной цели культивирования (целью является либо накопление биомассы, либо получение определенного продукта жизнедеятельности – метаболита).

Поверхностное культивирование заключается в выращивании аэробных микроорганизмов на поверхности жидких и сыпучих питательных сред. При этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. При поверхностном культивировании на жидких средах микроорганизмы растут в виде пленок. Осуществляется поверхностное культивирование в специальных ваннах – кюветах.

Глубинное культивирование проводится на жидких питательных средах, в которых микроорганизмы развиваются во всем объеме питательной среды. Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью. Осуществляется глубинное культивирование в специальных аппаратах – ферментаторах, снабженных мешалками и системой подвода стерильного воздуха для обеспечения роста аэробных микроорганизмов. Аэрирование – продувание стерильного воздуха через культуральную жидкость.

При периодическом культивировании весь объем питательной среды засевают чистой культурой, которую выращивают в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Следует отметить, что, так как культивирование ведется на невозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), то клетки все время находятся в меняющихся условиях. Таким образом, периодическую систему можно рассматривать как замкнутую систему.

При непрерывном культивировании культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает питательная среда и откуда с такой же скоростью отводится культуральная жидкость. Для микроорганизма создаются неизменные условия среды, поэтому непрерывную систему можно рассматривать как открытую систему.

Поверхностное культивирование может быть только периодическим, в то время как глубинное культивирование может осуществляться и периодическим, и непрерывным способом.

При периодическом способе культивирования популяция микроорганизмов проходит 7 стадий (фаз) роста (рис. 25).

1 2 3 4 5 6 7 
Рис. 25  Кривая роста статической культуры:

N – концентрация жизнеспособных клеток;

τ – продолжительность культивирования
1. Лагфаза. В этот период культура адаптируется к новой среде обитания. Активизируются ферментные системы, возрастает количество нуклеиновых кислот, клетка готовится к интенсивному синтезу белков и других соединений. Клетки не размножаются (скорость размножения равна нулю). Концентрация живых клеток постоянна и равна количеству внесенных клеток. Продолжительность этой фазы зависит от физиологических особенностей микроорганизма и от состава питательной среды.

2. Фаза ускорения роста. Эта фаза характеризуется началом деления клеток, увеличением общей массы и постоянным увеличением скорости роста культуры. Эта фаза обычно непродолжительна.

3. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста. В этот период микроорганизмы размножаются с постоянной максимальной скоростью. При этом логарифм числа клеток линейно зависит от времени. К концу этой фазы среда истощается вследствие катаболических и анаболических процессов, в среде накапливаются продукты жизнедеятельности микроорганизмов. Возникает и пространственная ограниченность, так как клетки мешают друг другу.

4. Фаза замедления роста. В этот период снижается скорость роста, небольшая часть клеток гибнет. Скорость роста выше скорости отмирания.

5. Стационарная фаза. Количество живых клеток достигает максимума. Скорость роста равна скорости отмирания клеток, поэтому концентрация жизнеспособных клеток остается постоянной.

6. Фаза ускорения отмирания. Количество отмерших клеток (скорость отмирания) становится больше количества образовавшихся клеток.

7. Фаза отмирания. Масса живых клеток значительно уменьшается, так как в среде нет питательных веществ, а запасные вещества клетки исчерпываются.

При непрерывном способе культивирования культура поддерживается в какой-то фазе роста.

Если цель культивирования – получение биомассы продуцента, процесс целесообразно вести в режиме логарифмической фазы, когда микроорганизм способен обеспечить максимальную скорость роста популяции.

Для поддержания культуры в логарифмической фазе культивирование микробной популяции проводят в условиях хемостата или турбидостата.

Рост в хемостате. Хемостат состоит из сосуда, в который вводят с постоянной скоростью питательный раствор. По мере поступления питательного раствора из него вытекает суспензия микроорганизмов с той же скоростью. При культивировании в условиях хемостата поддерживается постоянная концентрация одного из компонентов среды (например, углерода). Благодаря этому в условиях хемостата поддерживается постоянная скорость роста культуры. Культура микроорганизма находится в условиях динамического равновесия.

Рост в турбидостате. Работа турбидостата основана на поддержании постоянной концентрации живых клеток. В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, а скорость роста бактерий приближается к максимальной.

Если же целью культивирования является получение метаболита (например, этилового спирта), выход которого в среду обитания не соответствует логарифмической фазе роста, применяется способ непрерывного выращивания в двух или нескольких последовательно соединенных аппаратах, что позволяет как бы расчленить процесс на несколько стадий.