Определение сахаролитических свойств бактерий производят путем посева на среды
Добавил пользователь Дмитрий К. Обновлено: 20.09.2024
Определение биохимических свойств выделенных культур микроорганизмов.
студентка 3 курса
Биохимические свойства выделенных микроорганизмов изучают на третьем этапе. Культуру микроорганизмов, выросшую на скошенном агаре, проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При микроскопии обращают внимание на форму микроба, величину, расположение клетки. Специальными окрасками выявляют споры, капсулы, включения и жгутики.
Для идентификации культур, т.е. установления вида и типа бактерий, помимо морфологических и культуральных признаков изучают биохимические, антигенные и другие свойства.
Определение протеолитических свойств микробов. Действие протеолитических ферментов, т.е. способность микроорганизмов расщеплять белки, изучают на средах с.желатином, мадоком, сывороткой, пептоном. При посеве уколом в столбик желатиновой среды микробы—разлагающие желатин, разжижают среду. Действие микроорганизмов, разлагающих казеин (молочный белок), проявляется в пептонизации (просветлении) молока, которое приобретает вид молочной сыворотки.
В процессе ферментации пептонов микроорганизмами образуются индол (C8H7N), сероводород (H2S), аммиак (NH3,) и другие соединения.
Для обнаружения сероводорода в пробирку с МПБ, после посева исследуемой культуры, помещают под пробку узкую полоску фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца: уксуснокислого свинца - Pb(CH3COO)2 - 30 г; двууглекислого натрия – NaHCO3 - 1г; дистиллированной воды -100 мл. При наличии сероводорода индикаторная бумага чернеет вследствие образования сернистого свинца (PbS).
Аммиак определяют при помощи увлажненной красной лакмусовой бумажки. В присутствии аммиака бумажка синеет.
Определение сахаролитических свойств микробов. Способность микроорганизмов разлагать сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты, а иногда и газа изучают на средах Гисса. В состав этих сред входят пептонная вода, углевод (моносахариды - глюкоза, ксилоза, арабиноза; полисахариды - крахмал, гликоген), многоатомные спирты (глицерин, маннит, сорбит, инозит) и индикатор. Под действием образующейся при разложении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды. Газообразование определяется по наличию пузырьков газа в толщине полужидких сред или, если среда жидкая, в поплавке (стеклянная трубочка, верхний конец которой запаян).
Сахаролитические свойства изучают и на таких средах, как Эндо. Левина, Плоскирева. В состав этих сред входит молочный сахар - лактоза и если микроорганизмы разлагают его до кислоты, то цвет колонии изменяется соответственно индикатору, находящемуся в среде.
Определение ферментов микробов. Биохимическая активность микроорганизмов обусловлена их ферментативной деятельностью. Ферменты микроорганизмов являются биологическими катализаторами, определяющими метаболические процессы, протекающие в микробных клетках. Разные виды микроорганизмов нередко отличаются по набору ферментов, которые они способны синтезировать.
Плазмокоагулаза - выявляется в пробирочном опыте по определению скорости свертывания испытуемым микробом нитратной кроличьей или человеческой плазмы.
Гемотоксин (гемолизин) - вызывает лизис эритроцитов. Определяется при посеве испытуемых микробов на кровяной агар. Вокруг колонии наблюдается зона просветления среды.
Лецитиназа - разрушает лецитовителлин (лецитин) яичного желтка. Обнаруживается при посеве испытуемых микробов на желточно-солевой агар (ЖСА) по образованию вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком.
Гиалуронидаза - расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав соединительной ткани. В пробирку с испытуемой культурой внести гиалуроновую кислоту и после 30-минутной экспозиции при 37°С добавить 2 капли крепкой уксусной кислоты. При наличии фермента гиалуроновая кислота утрачивает способность образовывать сгусток.
1.2. Идентификация по протеолитической активности E.coli. Разложение микробами белка сопровождается образованием индола, сероводорода, аммиака.
Реакция на сероводород. Исследуемую культуру засевают в МПБ, под пробкой укрепляют полоску бумаги, пропитанной ацетатом свинца. Почернение бумаги после инкубации при 37°С в течение 2 – 3 суток свидетельствует о наличии сероводорода. E.coli, в отличие от возбудителей брюшного тифа и паратифа В, не образует сероводород.
1.3. Проба на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий прибавляют 2 – 3 мл эфира, содержимое энергично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида с хлороводородной кислотой).
В присутствии индола наблюдается розовое окрашивание, при осторожном наслаивании образуется розовое кольцо.
2. Идентификация стафилококков по биохимическим признакам .
2.1. Определение каталазной активности стафилококков.
На предметное стекло наносят каплю 1 – 3% раствора пероксида водорода и вносят в нее с помощью петли бактериальную культуру. Каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Выделение пузырьков O2 свидетельствует о наличии у данного вида бактерий фермента каталазы.
Каталазной активностью обладают стафилококки в отличие от стрептокков.
2.2. Определение плазмокоагулазной активности стафилококков.
Плазмокоагулаза – фермент S.aureus сворачивающий фибрин за счет активации предшествующего в плазме крови протромбина, тем самым, защищает бактерии от клеточных и гуморальных факторов иммунитета.
В пробирку с цитратной плазмой вносят исследуемую культуру, помещают в термостат при (37 ± 1)°С и через 1, 2, 3, 18 и 24 ч проверяют наличие свертывания плазмы. Реакция считается положительной независимо от степени свертывания плазмы. В отличие от других стафилококков S.аureus обладает плазмокоагулазной активностью.
Конкретно, что нужно? Каких именно бактерий ?
Общие данные пишу:
Биохимические свойства определяются по наличию фермента у бактерии. В связи с этим бактерии делятся на:
Липолитические: Расщепление жиров
Протеолитические: Расщепление белков
Сахаролитические: Расщепление сахаров
- Для определения сахаролитических свойств бактерий производится посев бактерий на так называемый "пёстрый ряд", иначе Среда Гисса, который содержит Лактозу, Сахарозу, Глюкозу, Мальтозу. В случае положительной реакции происходит образование кислоты с изменением цвета среды с сине-зеленого на желто-зеленый или желтый
- Для определения протеолитических свойств бактерий производится посев на желатин и пептон, если бактерии обладают свойсвтом расщеплять белки, то желатин будет разжижаться. При протеолитической активности микробы выделяют аммиак, чтобы проверить наличие аммиака используют лакмусовую бумагу, если есть активность к белкам, то бумага синеет.
Состав ферментов синтезируемый любой бактерией определяется ее геномом и является довольно стабильным признаком. Бактерии синтезируют разнообразные ферменты, принадлежащие к 6 основным классам.
Ферменты бактерий могут локализоваться в цитоплазме, цитоплазматической мембране или периплазматическом пространстве бактерий, это так называемые эндоферменты, другие – экзоферменты, выделяются в окружающую среду.
Функциональное значение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул органических и неорганических веществ в окружающей среде до более простых соединений. Они осуществляют контактное и внеклеточное переваривание веществ, повреждают ткани своих хозяев и др.
У бактерий различают три основные группы ферментов:
Конститутивные – постоянно синтезируемые бактериальной клеткой.
Индуцибельные (адаптивные) – синтез которых индуцируется соответствующим субстратом.
Репрессибельные – синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.
Одной из особенностей синтеза бактериальных ферментов является преобладание индуцибельных ферментов над конститутивными, что связано как с малым объемом протоплазмы, так и с их ролью главного механизма адаптации к меняющимися условиям внешней среды.
Другой особенностью синтеза ферментов у гетеротрофных бактерий является их выделение в огромном количестве в окружающую среду. Ферменты могут функционировать независимо друг от друга или быть тесно связанными между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в строгой последовательности. Последних называют – мультиферментные комплексы, например ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране.
Определение ферментов используют для идентификации бактерий – возбудителей инфекционных болезней, помимо изучения морфологических и культурных свойств.
К биохимическим свойствам относят: сахаролитические, протеолитические свойства, пигментообразование, токсинообразование.
Сахаролитические свойства.Бактерии характеризует неодинаковая способность использовать различные углеводы. Ферментация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов. Определение сахаролитических ферментов проводят на дифференциально-диагностических средах Гисса. Среды Гисса состоят из 1% пептонной воды, 0,5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза и др.), индикатора Андреде (кислый фуксин в 1н. растворе NaOH). В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов. Свежеприготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет. Исследуемую культуру засевают в пробирку. Результаты посевов учитываются через 24-48 часов. О разложении углеводов судят по изменению цвета среды. Среда приобретает красный цвет, в результате сдвига рН в кислую сторону, за счет образования кислоты. О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке.
Рис. Пробирка со средой Гисса до посева материала
Рис. Пробирка со средой Гисса после посева
Протеолитические ферменты – протеазы, катализирующие расщепление белка. На практике о протеолитической активности бактерий чаще судят по способности расщеплять белок до продуктов глубокого распада: индола и серововодорода. Для этого исследуемую культуру засевают на МПБ, между пробкой и горлышком пробирки укрепляют индикаторные бумажки. На сероводород – индикаторная бумажка пропитана уксуснокислым свинцом. При выделении Н2S – она чернеет. На индол – индикаторная бумага - пропитана раствором щавелевой кислоты, при выделении индола – она краснеет.
Рис. Проявление протеолитических свойств
Сахаролитические и протеолитические ферменты микроорганизмов весьма многообразны и универсальны (часто встречаются у представителей разных видов). Это обусловливает относительно невысокие дифференцирующие свойства традиционных сред. Для более четкой дифференциации культур у них желательно определять родо- и/или видоспецифические ферменты. В конце ХХ века в бактериологическую практику вошли дифференциальные среды нового поколения – хромогенные, принцип действия которых основан на выявлении высокоспецифичных ферментов у искомых микроорганизмов. К таким ферментам относятся, например, бета-D-глюкуронидаза Escherichia coli или бета-D-глюкозидаза энтерококков. Для обнаружения уникального фермента и, соответственно, идентификации микроорганизма, в состав среды вводят хромогенный субстрат – вещество, при расщеплении которого образуются окрашенные и/или флюоресцирующие продукты. В результате микробный рост окрашивается в определенный цвет или приобретает способность к флюоресценции при ультрафиолетовом облучении. Поскольку хромогенный субстрат или их смесь вводятся в состав сред (в том числе селективных) для первичного посева, то результат – выделение чистой культуры и ее идентификация – может быть получен уже в течение первых суток исследования.
Рис. Рост различных видов бактерий на хромогенных средах
Пигменты– красящие вещества различных классов химических соединений, выделяемых в среду или входящие в состав клеток. Синтезирующие пигменты бактерии чаще встречаются среди обитателей воздуха, почвы, воды. Они, как правило, защищают микробную клетку от ультрафиолетовых лучей. Среди патогенных для человека бактерий пигментообразование мало характерно. Данный признак относительно постоянен и цвет пигмента используют для идентификации пигментообразующих бактерий. Пигменты каратиноидного класса, имеющие желтые, лимонные, оранжевые тона, синтезируют стафилококки (S.aureus), микобактерии (M.tuberculosis, M.bovis). Растворимый в воде сине-зеленый пигмент пиоцианин синтезирует синегнойная палочка (P. aeruginosa). Пирагалолловый пигмент красного цвета продигиозин продуцируют серрации (S.marcescens).
Рис. Лимонно-желтые колонии S.aureus
Рис. Рост микобактерий на среде Левенштейна-Иенсена
Каталаза – железосодержащий фермент, катализирующий реакцию расщепления Н2О2 на воду и кислород. Присутствует у большинства аэробных и факультативно-анаэробных бактерий и отсутствует у облигатно анаэробных. Для определения в каплю Н2О2 на предметном стекле вносят испытуемую культуру. При наличие каталазы сразу же или через несколько секунд появляются пузырьки.
Рис. Тест на каталазу
Оксидазы – группа ферментов, характерных для аэробов и отсутствующих у анаэробов и большинства факультативно-анаэробных бактерий. Для определения на фильтровальную бумагу смоченную 1% р-ром тетраметилпарафенилдиамин-дегидрохлорида (реактив Кодака) наносят полосу из испытуемой культуры. В положительном случае через несколько секунд появляется фиолетовое окрашивание.
Рис. Тест на оксидазу
Коммерческие тест-системы
В настоящее время для биохимической идентификации бактерий используются коммерческие тест-системы отечественного и зарубежного производства: система индикаторная бумажная (СИБ), различные мультимикротесты (ММТ), тест-системы API, автоматизированные бактериологические идентификационные анализаторы. Учет результатов может проводиться визуально или автоматически.
Рис. Система индикаторная бумажная (СИБ)
Мультимикротесты (ММТ) представляют собой пластиковые планшеты, в лунках которых находятся различные субстраты с индикаторами, на которые наносится взвесь изучаемой культуры. После суточного инкубирования в термостате по изменению цвета содержимого лунок судят о биохимических свойствах культуры.
Рис. Изменение цвета содержимого лунок в планшете мультимикротеста
Рис. Результаты идентификации трех культур тест-системой API
Автоматизированные бактериологические идентификационные анализаторысостоят из бактериологического анализатора, идентификационных панелей и программного обеспечения. Cовременные анализаторы, разработанные для автоматизации и стандартизации процесса микробиологического анализа, проводят: идентификацию микробов, определение чувствительности к антибиотикам и статистическую обработку результатов исследования. Идентификация производится на основе системы биотипирования микроорганизмов по более чем 30 биохимическим реакциям одновременно. Полный анализ проходит от 4 до 24 часов, в зависимости от вида микроорганизма. Спектр идентификации включает более 400 видов клинически значимых микроорганизмов.
Рис. Врач бактериолог за работой на автоматизированном бактериологическом анализаторе. Компания Ситилаб, Казань
Шпоры запись закреплена
25. Понятие о чистой культуре. Выделение чистых культур анаэробных бактерий.
Чистой культурой называется популяция бактерий од ного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары. Биовары, различающие ся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по анти генным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо сим волами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактерио логических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.
^ Колония представляет собой видимое изолированное скоп ление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей мор фологии, цвету и другим признакам.
26. Рост и размножение бактерий. Фазы развития популяции.
Рост – координированное воспроизведение клеточных компонентов и структур, ведущий в конечном итоге к увеличению массы клетки.
Размножение – увеличение числа клеток в популяции.
Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты,как и грибы, размножаются спорами.
Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные – путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.
Делению клетки предшествует репликация бактериальной хромосомы. Она происходит в три этапа: инициация, элонгация и терминация.
Размножение бактерий в питательных средах.
Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз:
Лаг- фаза – период между посевом и началом размножения. (4-5 часов). Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению, нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов.
Фаза логарифмического(экспоненциального) роста – период интенсивного деления бактерий. (5-6 часов) Бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, НК и др.
Фаза стационарного роста- количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальных уровень. (М-концентрация)
Фаза гибели - отмирание бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий.
27. Бактериологический метод исследования, его этапы.
Бактериологический метод исследования является важнейшим в практической деятельности любой микробиологической лаборатории. От правильного его выполнения зависит определение этиологического фактора, который вызывал заболевание, и, соответственно, выбор тактики лечения инфекционного больного. Важность этого метода объясняется тем, что во многих случаях врачи имеют дело с микробными ассоциациями, тогда необходимо устанавливать роль каждого из микробов в возникновении болезни.
Потому перед освоением основных принципов и методов выделения чистых культур необходимо овладеть техникой посевов и пересеваний бактерий в жидких и на плотные питательные среды.
Бактериологическое исследование подразумевает получение чистой культуры возбудителя и установление его принадлежности к виду, роду и т. д. Данный метод включает в себя определенные этапы.
Вначале выделяется чистая культура возбудителя с помощью посева на плотные питательные среды. Выбор питательной среды зависит от свойств предполагаемого возбудителя. На следующем этапе осуществляют исследование полученных колоний бактерий макроскопическим и микроскопическим методами. Затем из небольших фрагментов каждой из образовавшихся колоний готовят мазки, которые окрашивают по Грамму. Далее исследуют их под микроскопом, определяя свойства, присущие выделенной культуре, и проверяют ее чистоту.
Оставшуюся часть колонии переносят в специальные пробирки со скошенным агаром (плотной питательной средой) для накопления чистой культуры с целью последующего полного изучения данной колонии. Все пробирки с агаром ставят на 18—24 ч в термостат. На 2-м этапе бактериологического исследования зачастую учитывают количество образовавшихся колоний микроорганизмов. Это имеет огромное значение при наличии у пациента заболеваний, вызываемых условно-патогенной микрофлорой. На З-м этапе бактериологического исследования проводятся идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и установление степени его чувствительности к антибиотикам и прочим химиотерапевтическим лекарственным препаратам. Идентификацию культуры осуществляют по морфологическим, биохимическим, тинкториальным, антигенным, культуральным и токсикогенным свойствам:
Читайте также: