На выход вторичных продуктов в культуре ткани растений влияет

Добавил пользователь Skiper
Обновлено: 19.09.2024

КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ РАСТЕНИЯ — способность растительных клеток размножаться на искусственных питательных средах. Основана на выращивании в длительной пересадочной культура тканей растений в виде недифференцированной каллусной массы в стерильных условиях. В природе каллусообразование встречается в основном как реакция на повреждение растения, когда на месте раны образуется нарост, а в культуре ткани все растительные клетки превращаются в каллусные. Каллусы растений легко образуются на эксплантатах из различных органов: отрезков стебля, листа, корня, проростков семян, фрагментов паренхимы ткани клубня, органов цветка, плодов, зародышей и т. д.

При помещении эксплантатов на питательную среду паренхимные клетки дедифференцируются, переходят к делению, образуя однородную недифференцированную биомассу, получившую название каллуса. В асептических условиях каллус отделяют и помещают на поверхность агаризованной питательной среды для дальнейшего роста. В результате получают культуру каллусной ткани, которую можно поддерживать неограниченно долго, периодически разделяя ее на трансплантаты и пересаживая на свежую питательную среду.

Одна из важных особенностей культура тканей растений — сохранение способности к синтезу вторичных веществ, свойственных данному виду, — алкалоидов, гликозидов, эфирных масел, стероидов и др. Эта особенность определяет практическую ценность культура тканей растений в области выращивания биомассы клеток как принципиально нового вида лекарственного сырья. В настоящее время технологии, основанные на культивировании тканей высших растений для получения редких и дорогостоящих веществ, включены в биотехнологические программы, создаваемые в России и во многих странах мира (см. Биотехнология).

Использование технологий, основанных на промышленном выращивании культур тканей продуцентов в качестве лекарственного сырья, имеет ряд преимуществ перед традиционными способами получения сырья. Однако использование такого сырья в фармации экономически выгодно только для продуктов, рыночная стоимость которых достаточно велика на международном рынке.

Культуру тканей растений в настоящее время выращивают главным образом двумя способами: поверхностным — на агаризованных питательных средах или различных гелеобразующих подложках и в жидкой питательной среде. В жидкой питательной среде каллус легко распадается на отдельные агрегаты клеток и дает начало суспензионной культуре. Известны два способа культивирования тканей в жидкой питательной среде: а) накопительное и б) непрерывное.

Важный фактор создания эффективной биотехнологической системы — подбор питательной среды, обеспечивающей потребности культуры ткани продуцента в химических компонентах, необходимых для оптимального биосинтеза целевого продукта. Обязательными компонентами питательных сред служат смеси минеральных солей (макро- и микроэлементов), фитогормоны, выступающие как факторы регуляции процессов клеточного деления и дифференциации, и, поскольку питание культур тканей гетеротрофно, источник углерода вводится в состав среды в виде сахарозы. Получение автотрофных культур тканей — пока задача будущего. При приготовлении питательных сред в качестве подложки используют агар-агар, образующий с водой гель. В последнее время в качестве подложки для культуры тканей растений испытывают и другие гелеобраующие вещества: силикагели, биогели, полиакриламидные гели, пенополиуретан и др.

Культура тканей растения служит источником значительной генетической изменчивости, которую называют сомаклональной. Благодаря этой особенности культуру ткани стали интенсивно использовать в генетико-селекционных исследованиях для улучшения свойств растений. Сомаклональная изменчивость представляет основу для получения клеточных линий и штаммов с высокой биосинтетической способностью. Для увеличения спектра изменчивости используют мутагенез и селекцию на клеточном уровне наиболее продуктивных клеточных линий. Получение мутантных клеточных линий в самом ближайшем будущем будет дополнено методами создания продуктивных штаммов путем гибридизации соматических клеток и генетической инженерии (см. Биотехнология).

В СССР развитие метода культуры тканей лекарственных растений связано с именем Р. Г. Бутенко. С 1967 г. по инициативе И. В. Грушвицкого в создана первая лаборатория культуры тканей лекарственных растений в Ленинградском химико-фармацевтическом институте.

Характеристика клеток растений, находящихся в природных условиях. Понятие культуры тканей и культивирования каллусных клеток. Изучение метода индуцированного мутагенеза. Сферы применения культур растительных клеток. Процессы во вторичных метаболитах.

Рубрика	Биология и естествознание
Вид	реферат
Язык	русский
Дата добавления	27.04.2014
Размер файла	31,8 K

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Культивирование клеток и тканей растений - сравнительно молодая отрасль биотехнологии. Как известно, в природных условиях клетки растений находятся в тканях и органах, защищены от механических воздействий внешней среды.

Кроме того, эти клетки нуждаются во множестве компонентов минеральной и органической природы для метаболизма и роста, поэтому эксперименты культивирования этих клеток in vitrо в прошлом завершались неудачно. Сначала к минеральным средам добавляли экстракты растений или сыворотку, и лишь в 1922 году Роббинсу удалось на синтетической питательной среде осуществить рост меристемы кончиков корней томатов и кукурузы. Начало практического культивирования тканевых культур растительного происхождения можно отнести к 1955 г.

Растения являются незаменимым источником получения очень многих практически важных веществ. При этом следует подчеркнуть, что промышленное получение некоторых соединений, например, сердечных гликозидов, флавоноидов, кумаринов, эфирных масел достигается только путем выделения их из растительного сырья. Между тем возможности получения так называемых "метаболитов интереса" в достаточном количестве зачастую ограничены. Это связано с сокращением ресурсов некоторых ценных дикорастущих растений, принадлежностью многих лекарственных растений к группам эндемов, редким и исчезающим видам. В связи с этим большой интерес в качестве источника биологически активных веществ представляют культуры растительных клеток.

Использование данных методик - пример слияния высоких технологий, науки и экономически выгодного способа получения лекарственного сырья. Сбор дикорастущего сырья наносит вред экологической обстановке региона и всей планете в целом, а при неправильном сборе может и вовсе привести к вырождению зарослей. Культивировать целое растение также не практично если в качестве сырья используется, к примеру, только его корневища или корни. Это значит, что вся надземная часть в лучшем случае идёт на корм животным или просто выбрасывается. Культивирование изолированных клеток и тканей даёт возможность получать именно то сырьё которое необходимо, и кроме того позволяет увеличить количество и качество самих биологически активных веществ.

В самом общем смысле культура клеток и тканей - это искусственное in vitro индицирование делений клеток или выращивание в пересадочной культуре тканей, возникших путём пролиферации клеток изолированных сегментов разных частей растения.

Все объекты, культивируемые in vitro, выращиваются стерильными. Стерилизуются исходные кусочки ткани растений (экспланты), питательная среда, антисептически в специальных боксах стерильным инструментом проводятся манипуляции по выращиванию объектов. Сосуды в которых культивируются ткани и клетки, закрываются так, чтобы предотвратить инфицирование в течение продолжительного времени. В культуре тканей лекарственных растений можно выделить три главных направления: получение недифференцированной каллусной массы, создание источников генетического разнообразия форм растений, а так же клеточную селекцию и клональное микроразмножение растений. В природе каллусообразование - естественная реакция на повреждение растений. В культуре изолированных тканей при помещении экспланта (т. е., фрагмента ткани или органа) на питательную среду его клетки дедифференцируются, переходят к делению, образуя однородную недифференцированную массу - каллус. В асептических условиях каллус отделяют и помещают на поверхность агаризованной питательной среды для дальнейшего роста.

В результате получают культуру каллусной ткани, которую можно поддерживать неограниченно долго, периодически разделяя её на трансплантаты и пересаживая её на свежую среду. Каллусы легко образуются на эксплантах из различных органов и частей растений: отрезков стебля, листа, корня, проростков семян, фрагментов паренхимы, тканей клубня, органов цветка, плодов, зародышей и т. д.

Культивирование каллусных клеток проводят главным образом двумя способами: на агаризованных питательных средах или различных гелеобразующих подложках (силикагель, биогели, полиакриламидные гели, пенополиуретан и др.) и в жидкой питательной среде. В жидкой питательной среде каллус легко распадается на отдельные агрегаты клеток и даёт начало так называемой суспензионной культуре.

Каллусные клетки в культуре in vitro подвержены значительной генетической изменчивости. Изменчивость геномов может приводить к генетическим изменениям у растений - регенерантов, полученных из культуры каллусных клеток, клеточных суспензий или изолированных протопластов. Такие растения получили названия сомаклональных вариантов. Сомаклональные варианты, сохраняя основные свойства прототипа, часто выгодно отличаются от него устойчивостью к болезням, экологическим стрессам, а иногда несколько изменённой биосинтетической способностью и более высокой продуктивностью.

Неотселектированные недифференцированные клетки накапливают, как правило, незначительное, по сравнению с интактным растением, количество веществ специализированного обмена. Только благодаря правильно разработанной стратегии получения высокопроизводительных штаммов к настоящему времени получены культуры тканей, в которых содержание вторичных продуктов достаточно велико, чтобы служить лекарственным сырьем. Однако для многих культур неоднократные попытки различных исследователей определить условия накопления продуктов, характерных для родительских растений, были неудачными. Это касается, в частности, индукции морфинановых алкалоидов в культуре ткани Papaver somniferum, винбластина - в Catharanthus roseus, хинолиновых алкалоидов - в Cinchona ledgeriana, дигоксина - Digitalis lanata и др.

Чаще всего в клеточных культурах при длительном культивировании снижается или совсем теряется способность клеток накапливать соединения вторичного метаболизма из-за возникновения малоактивных, но более жизнеспособных вариантов. Снижение биосинтетического потенциала в культуре in vitro происходит из-за подавления дифференциации клеток и их специализации, т. е., в результате потери способности к реализации генетической информации, относящейся ко вторичному обмену.

Возможен случай постепенного (в течение нескольких лет) увеличения числа клеток со сниженным синтезом метаболитов. И, наконец, в случае полной нестабильности клетки популяции очень быстро теряют свой биосинтетический потенциал. Вопрос о стабильности и нестабильности тесно связан с изучением биологии клеток разных популяций.

В организме растения синтез метаболитов, их транспорт и отложение в запас находятся под строгим контролем развития. Часто эти события не только разведены во времени, но и происходят в разных органах растения. Клетка вне организма обычно не транспортирует метаболиты в соседние клетки или в питательную среду, хотя в ряде случаев это явление наблюдается (биосинтез алкалоидов в клеточных культурах мака).

На выход вторичных продуктов в культурах растительных клеток влияют многие факторы, однако все способы регуляции вторичного метаболизма в культуре in vitro можно разделить на две группы: физиологическая и генетическая регуляции синтеза вторичных метаболитов.

Подбор физических и химических условий культивирования является наиболее простым и часто применяемым подходом для повышения продуктивности. В основе физиологического регулирования процессов вторичного синтеза лежит изучение влияния факторов культивирования на рост и метаболизм клеток. Большое внимание уделяется таким факторам культивирования, как регуляторы роста, минеральные вещества, витамины, сахара, свет, аэрация, температура, а также иммобилизация клеток и обработка элиситорами. Во многих случаях эти работы привели к успеху, однако они выполняются эмпирически и поэтому длительны и трудоемки. К тому же следует оговориться, что несмотря на эффективность повышения уровня биосинтеза физиологическими методами, добиться количественно значимых изменений в недифференцированных клеточных культурах, сопоставимых с уровнем в интактном растении, лишь за некоторым исключением, не удается. Стимулирование же синтеза элиситорами носит, к сожалению, временный характер.

Более эффективной в этом плане является генетическая регуляция синтеза вторичного метаболизма в системе in vitro.

С использованием экспериментального мутагенеза стало возможным получение довольно продуктивных штаммов. С помощью этого метода в ИФР РАН был получен мутантный штамм Dioscorea deltoidea DM-0.5 (мутаген - N- нитрозометилмочевина, доза - 0.5 ммоль/ч) - сверх продуцент фуростаноловых гликозидов, высокая способность к синтезу - 6-8% в сухой массе клеток - сохранялась в течение длительного времени (около 30 лет).

В лаборатории биохимии и биотехнологии растений также получены значительные результаты по получению культур растительных клеток - продуцентов экдистероидов. В начале 90-х годов были получены каллусные культуры Serratula coronata и Ajuga reptans - продуценты экдистероидов. Полученные штаммы различались по степени соответствия интактным растениям по количественному составу экдистероидов и соотношению индивидуальных компонентов. Если в клеточных культурах S. Coronata наблюдали заметное снижение уровня биосинтеза по сравнению с интактными растениями (20-100 раз), то ряд каллусных культур A. Reptans по суммарному содержанию экдистероидов не уступал дикорастущим растениям. Для обеих клеточных культур была отмечена тенденция к снижению уровня синтеза экдистероидов с увеличением продолжительности культивирования, однако были выявлены штаммы и со стабильным уровнем синтеза. Среди длительно культивируемых каллусных культур S. Coronata и A. Reptans были выявлены штаммы с относительно высоким содержанием 20-гидроксиэкдизона (экдистероида, обладающего высоким тонизирующим и ранозаживляющим действием), из которых в 1999 г. нами были получены суспензионные культуры. Методы глубинного культивирования клеток высших растений в последние годы привлекают все больший интерес, поскольку этот метод обладает рядом преимуществ перед поверхностным культивированием (каллусными культурами): обеспечение одинаковых условий для всех клеток популяции, увеличение скорости их роста и биосинтетического потенциала, возможность автоматизации процессов.

Культуры клеток высших растений имеют две сферы применения:

1. Изучение биологии клетки, существующей вне организма, обуславливает ведущую роль клеточных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитологии растений. Популяциям растительных клеток присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференцированной активности генов) и физиологические. При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции идет размножение клеток, фенотип и генотип которых соответствуют данным условиям выращивания, следовательно, популяция эволюционирует. Все это позволяет считать, что культуры клеток являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока мало изучены. Культуры клеток и тканей могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения;

2. Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.

Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:

1) Получение биологически активных веществ растительного происхождения:

- традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);

- синтез новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а в некоторых случаях и направленному мутагенезу;

- культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ. В результате биотрансформации получают уникальные биологически активные продукты на основе синтетических соединений или веществ промежуточного обмена растений других видов.

2) Ускоренное клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3) Получение безвирусных растений.

4) Эмбриокультура и оплодотворение in vitro часто применяются для преодоления постгамной несовместимости или щуплости зародыша, для получения растений после отдаленной гибридизации. При этом оплодотворенная яйцеклетка вырезается из завязи с небольшой частью ткани перикарпа и помещается на питательную среду. В таких культурах можно также наблюдать стадии развития зародыша.

5) Антерные культуры - культуры пыльников и пыльцы используются для получения гаплоидов и дигаплоидов.

6) Клеточный мутагенез и селекция. Тканевые культуры могут производить регенеранты, фенотипически и генотипически отличающиеся от исходного материала в результате сомаклонального варьирования. При этом в некоторых случаях можно обойтись без мутагенной обработки.

7) Криоконсервация и другие методы сохранения генофонда.

8) Иммобилизация растительных клеток.

9) Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.

10) Конструирование клеток путем введения различных клеточных оганелл.

11) Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.

Синтез вторичных метаболитов.

Вторичный метаболизм культивируемых клеток привлекает всё больше внимания исследователей, это обусловлено, прежде всего перспективностью промышленного использования культивируемых клеток растений для получения соединений специализированного обмена растений. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с возрастающей остротой экологических проблем. В медицине 25% всех применяемых лекарств содержат соединения растительного происхождения. Если приплюсовать к этому потребности пищевой промышленности, парфюмерии, сельского хозяйства, то становится очевидной необходимость замены плантационного, а тем более дикорастущего сырья на гарантированно получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток, содержащую необходимые соединения в достаточном количестве.

Как показал почти полувековой опыт исследования вторичных соединений в клеточных культурах растений (с 1940 года), для этого необходимо решение многих фундаментальных проблем биологии культивируемых клеток. растение мутагенез метаболит

Наиболее серьёзной из них является разработка стратегии контроля синтеза вторичных соединений в культивируемых клетках растений. До сих пор неясно, возможна ли разработка единой стратегии или она должна быть специфической для разных классов вторичных соединений, или же индивидуальной для каждого конкретного случая.

Список использованной литературы

1. Артамонов В.И. Биотехнология - агропромышленному комплексу. М.: Наука, 1999. 160 с.

2. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: ИЦ и Г СО РАН, 1993. 241 с.

3. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990. 334 с.

4. Биотехнология / Под ред. А.А. Баева. М.: Наука, 1994. 309 с.

5. Блинов А.Г. Бесклеточные белоксинтезирующие системы // Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990. С. 80-86.

6. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1994 г. 272 с.

7. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1994. 272 с.

8. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1996. 286 с.

9. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений. Алматы: Конжык, 1996. 272 с.

10. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений // Культура клеток растений. М.: Наука, 1991. С. 37-50.

11. Кирай З., Барабаш З. Результаты и перспективы использования биотехнологии в растениеводстве и защите растений // Международный агропромышленный журнал. 1990. №3. С. 7-10.

Подобные документы

Применение клеточных технологий в селекции растений. Использование методов in vitro в отдаленной гибридизации. Работы по культивированию каллуса с целью получения нового селекционного материала. Гибридизация соматических клеток и ее основные результаты.

реферат [28,6 K], добавлен 10.08.2009

Основные разновидности живых клеток и особенности их строения. Общий план строения эукариотических и прокариотических клеток. Особенности строения растительной и грибной клеток. Сравнительная таблица строения клеток растений, животных, грибов и бактерий.

реферат [5,5 M], добавлен 01.12.2016

Исследование особенностей вторичного обмена растений, основных методов культивирования клеток. Изучение воздействия биологически активных растительных соединений на микроорганизмы, животных и человека. Описания целебного действия лекарственных растений.

курсовая работа [119,9 K], добавлен 07.11.2011

Химический состав клеток, функции внутриклеточных структур, функции клеток в организме животных и растений, размножение и развитие клеток, приспособления клеток к условиям окружающей среды. Положения клеточной теории по М. Шлейдену и Т. Шванну.

презентация [1,3 M], добавлен 17.12.2013

Образование тканей из зародышевых листков (гистогенез). Понятие как стволовых клеток как полипотентных клеток с большими возможностями. Механизмы и классификация физиологической регенерации: внутриклеточная и репаративная. Виды эпителиальных тканей.

Клеточная биотехнология базируется на использовании культуры клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы манипулировать клетками, нужно выделить их из растения и создать такие условия, при которых они могли бы жить и размножаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получил название культуры изолированных тканей и приобрёл особое значение в связи с возможностью его использования в биотехнологии.

Содержание

Введение ………………………………………………..…………………………….….3
1. Векторы генетической инженерии растений…………………….………….……. 8
2. Культура каллусных тканей и их морфогенетические особенности……….……. 8
3. Суспензионная культура………………………. ……………………….……..…. 12
4. Клональное размножение растений……………………………………….……..…14
5. Культивирование протопластов………………………………………………. …19
6. Перспективы получения лекарственных средств на основе клеток растений…. 21
Заключение……….………………………………………………………………. …. 26
Список литературы. …………………………………………………

Работа состоит из 1 файл

бт.doc

В качестве источников углерода используют глюкозу, сахарозу или их смеси. Сахароза не всегда может быть подходящим компонентом среды для культивирования протопластов. В некоторых случаях требуется добавление рибозы, ксилозы, фруктозы, маннозы или других сахаров. Кроме этого в состав питательных сред должны входить такие витамины, как тиамин, пиридоксин и никотиновая кислота. При небольшой плотности высева требуется добавление и других витаминов.

Маннит, сорбит и их комбинация могут быть использованы в качестве осмотических стабилизаторов.

В качестве источников органического азота применяют обычно гидролизат казеина, который представляет собой смесь аминокислот. Его добавляют в том случае, если в среде недостаточное количество неорганического азота, а его содержание уже увеличить нельзя.

Ауксины и цитокинины требуются для клеточного деления и дальнейшего развития растительных клеток. Обычно в качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксус-ную кислоту и нафтилуксусную кислоту, в качестве цитокининов — кинетин, бензиладенин. Оптимальные концентрации варьируют, и их подбирают в каждом отдельном случае.

Большое внимание при культивировании протопластов уделяется соблюдению и других условий среды — так, рН среды — 5,4—5,8, температура — 22—28 °С. Иногда требуется слабое освещение. Жизнеспособность протопластов зависит от начальной плотности высева. Обычно их культивируют при плотности высева от 104 до 106 на 1 мл среды.

Можно изменять соотношения аммонийного и нитратного азота в зависимости от потребности в них клеток, увеличивать концентрацию СаСl₂ для стабилизации образующейся клеточной стенки. После того как образовались и начали делиться клетки, они могут быть помещены в условия культивирования, применяемые обычно для клеток растений.

Иногда для повышения числа делящихся протопластов в среду добавляют различное количество кондиционированной среды, на которой некоторое время росли клетки, или же используют так называемый кормящий слой, состоящий из облученных клеток. Клетки в кормящем слое не делятся, но остаются метаболически активными, т.е. продукты жизнедеятельности инактивированных клеток восполняют необходимые компоненты среды. Обычно эти методы применяются в том случае, если протопласты высевают на питательную среду с небольшой плотностью.

Единичные протопласты можно культивировать в небольших количествах среды в пластмассовых или стеклянных чашках Купрака, а также в микрокамерах. Такое культивирование необходимо для получения колоний из одной клетки и для наблюдения за ее дальнейшим развитием. В последующем при нанесении таких колоний на агаризованную среду определенного состава можно получить каллус, а затем и целое растение.

Как правило, при благоприятных условиях выделения и культивирования на третьи-четвертые сутки с момента нысева наблюдаются первые деления протопластов. В большинстве случаев затем образуются многоклеточные агрегаты, развивающиеся в дальнейшем в каллус, который способен регенерировать целое растение. Растения-регенеранты из протопластов получены в настоящее время для целого ряда сельскохозяйственных культур.

6. Перспективы получения лекарственных средств на основе клеток растений

В 60-х гг. XX в. была доказана способность клеток и тканей растений к росту, делению, органообразованию и вторичному метаболизму, т.е. возможность любой клетки образовывать полноценное растение, поскольку генетический и физиологический потенциал, необходимый для вторичных метаболитов, присутствует в каждой клетке.

В настоящее время разработано промышленное получение ряда ценных веществ из растительной биомассы методом in vitro. Хорошо налажен в Японии выпуск следующих лекарственных препаратов: шиконин (из воробейника аптечного), убихинон (из табака), дигоксин (из наперстянки шерстистой), диосгенин (диоскорея дельтовидная).

Промышленное производство лекарственных веществ на основе культур клетки гарантирует достаточный выход продукта. Это можно подтвердить путем сравнения процента выхода активного начала из биомассы цельного сырья, взятого в эквивалентном количестве.

Для выращивания культур необходимы высокопродуктивные клетки растения. Так, для культивирования родиолы розовой более перспективными являются клетки корневой системы.

Для обеспечения роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма необходим подбор ингредиентов питательной сре-ды, который проводят и оценивают по двум направлениям:

•влияние среды на формирование биомассы;

•влияние состава среды на синтез вторичных продуктов.

Компоненты субстрата для выращивания культур клеток растений должны включать: основные неорганические питательные вещества, источники железа, органические добавки (витамины, регуляторы роста), источники углерода.

Существует несколько стандартных питательных сред, широко используемых при культивировании, но количество регуляторов роста в них варьирует в зависимости от вида растений. На выход продукта может влиять концентрация источника углерода и других компонентов среды. Так, в культуре клеток барвинка розового увеличение выхода алкалоидов было связано с повышением в среде концентрации сахарозы, а в культуре клеток моркови накопление антоциана стабилизировалось, когда в качестве лимитирующего фактора использовали фосфаты.

В качестве регуляторов роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма используют ауксины, среди которых индолил-3-уксусная кислота, нафтилуксусная кислота, 2,4-дихлорфенок-сиуксусная кислота, а также цитокины. На синтез вторичных метаболитов влияют внесенные в питательную среду известные предшественники, которые могут стимулировать определенные ферментативные пути метаболизма. Введение фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивало выход диосгенина на 100 %. На степень накопления вторичных метаболитов влияют также свет, температура, рН, а при суспензионном культивировании — аэрация и перемешивание, состав питательной среды и концентрации ее компонентов.

Таким образом, создавая для каждой культуры клеток растений благоприятные условия на стадии роста и синтеза вторичных метаболитов, можно гарантировать получение любого продукта с метаболической активностью.

Для накопления промышленного сырья путем выращивания клеток и тканей растений используют каллусные и суспензионные культуры; последние получают из каллуса.

Преимущества получения ряда фармакологических веществ на основе культивирования растений заключаются в следующем:

1. независимость от климатических, сезонных и географических условий;

2. стабильность выпуска фарамацевтической продукции в течение года;

3. уменьшение площади почвы, на которой выращиваются лекарственные растения.

Культуры клеток растений могут синтезировать все классы соединений вторичного обмена (алкалоиды, терпеноиды, фенолы, гликозиды, бетаины). Синтез лекарственных веществ происходит либо во время эксконенциальной фазы, когда наиболее интенсивны метаболические процессы, либо в стационарной фазе развития популяции клеток. Суспензионные культуры — это процесс получения биомассы в течение нескольких десятков суток в биореакторах с постоянным перемешиванием и при соблюдении правил асептики.

В России разработана технология получения субстанций женьшеня, родиолы розовой, унгерии на основе каллусных культур. Данные препараты нашли применение в медицине, косметологии и пищевой промышленности.

Выращивание растительных клеток осуществляется в биореакторах различного объема (до 200 л) с системами перемешивания (турбинное, восходящими потоками воздуха, встряхивание).

В настоящее время для получения биомассы и продуктов пторичного метаболизма применяют периодическое и проточное культивирование.

Для регуляции процесса проточного культивирования используют хемостатный и турбидостатный методы, т.е. такие подходы, как и при использовании в качестве продуцентом клеток микроорганизмов. Однако для процесса ферментации применяют специализированные типы биореакторов С пневматическим перемешиванием. Наиболее разработаны периодические способы выращивания растительных культур.

Перспективна технология получения БАВ с помощью иммобилизованных клеток, обладающих более низкой скоростью роста и способностью к интенсивной выработке метаболитов. Одно из условий при иммобилизации клеток — выделение метаболита в питательную среду, из которой он может быть легко извлечен (например, клетки, продуцирующие алкалоиды). Преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с суспензионными культурами:

•многократное использование биомассы;

•четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма;

•увеличение продолжительности культивирования на стадии продуцирования;

•получение большого количества вторичных метаболитов.

Другим вариантом использования культур клеток растений в фармацевтической промышленности следует считать их применение для биотрансформации.

Биотрансформация — метод, использующий ферменты, локализованные в клетке растения, которые способны изменять функциональные группы добавленных извне химических соединений. Он применяется для повышения биологической активности данной конкретной химической структуры и осуществления серии специфических химических реакций за счет включения одного или нескольких последовательно связанных ферментов.

Производство серпентина на основе суспензионных культур частично дифференцированных клеток меристемы Catharatus roseus оказалось эффективным и экономически оправданным лишь после того, как были получены субклоны, способные накапливать за 10-суточный цикл выращивания до 25 г сухого вещества на 1 л суспензионной культуры.

Аналогичная ситуация имела место и при организации биотехнологического производства настойки женьшеня. Количественный выход биологической субстанции в пересчете на сухое вещество каллуса женьшеня было ниже, чем из женьшеня, полученного при плантационном выращивании, примерно в три-четыре раза.

Данная статья посвящена основным технологиям культивирования тканей растений, истории открытия, рекомендации по организации лаборатории для проведения исследований по культуре тканей, приведены методики работы в асептических условиях. Описаны основные методы и принципы культивирования. За последние пять десятилетий были достигнуты значительные успехи в области культуры растительных клеток, тканей и органов. В настоящее время протоколы культуры клеток, тканей и органов растений используются во всех областях исследований и разработок биотехнологии растений.

Ключевые слова: питательная среда, клетка, культура, растение, среда, ткань.

Культура тканей растений представляет большой интерес для молекулярных биологов, селекционеров растений и даже для промышленников, поскольку она помогает улучшить растения, имеющие экономическое значение. В дополнение ко всему этому культура тканей вносит огромный вклад в понимание закономерностей и ответственных факторов роста, метаболизма, морфогенеза и дифференциации растений. [1]

Считается, что немецкий ботаник Готлиб Хаберланд был первым человеком, который культивировал изолированные, полностью дифференцированные клетки в 1898 году . Это был самый первый шаг к началу выращивания растительных клеток и тканей. [2]

Таким образом, в течение длительного времени эмпирический подход являлся практически единственным методом при работе с изолированными клетками и тканями растений. Его невысокая эффективность привела исследователей к пониманию необходимости изучения биологии культивируемых объектов на всех уровнях — молекулярном, субклеточном, клеточном и тканевом, без чего невозможна разработка практически важных технологий. [2]

Основными требованиями к культуре тканей растений являются:

1) Организация лаборатории

2) Асептические условия

Во-первых, в стандартной лаборатории тканевых культур должно быть несколько основных помещений:

— Комната для подготовки, стерилизации и хранения питательных сред.

— Средства для мытья лабораторных изделий, эксплантов.

— Место для хранения лабораторного оборудования.

— Помещения для культивирования или инкубаторы, в которых можно поддерживать температуру, влажность, свет и т. д.

— Зона наблюдения и сбора данных.

Во-вторых, устанавливаются отдельные обязательные требования к асептическим условиям в лаборатории. Поддержание асептических условий — самый важный и сложный аспект экспериментов по культивированию in vitro

Исходя из этого, необходимо иметь полные асептические условия для и вокруг аппарата культуры, стеклянной посуды, среды и т. д. для предотвращения загрязнения питательной среды. Из-за загрязнения в среде растут микроорганизмы, что в конечном итоге убивают растительную ткань. Размеры стерилизационной комнаты должны составлять 6 × 6 × 4,5 кв. м. В помещении должен быть автоклав. В случае отсутствия автоклава можно также использовать скороварку. При проведении экспериментов с культурой тканей в лаборатории должны быть аптечки и огнетушители, чтобы избежать несчастных случаев. Кроме того, при обращении с токсичными химикатами следует уделять должное внимание. Должны храниться в контейнерах и бутылках с правильной маркировкой. [3]

Общая методика выращивания растительных клеток, тканей и органов практически одинакова, с небольшими вариациями для разных растительных материалов. Существуют определенные основные этапы восстановления полноценного растения из эксплантата, выращенного на питательной среде.

К общераспространенным методам культивирования на сегодня относятся: клональное микроразмножение, соматический эмбриогенез.

Микроразмножение начинается с отбора растительных тканей (эксплантата) из здорового, сильного материнского растения. Любая часть растения (лист, апикальная меристема, почка и корень) может использоваться в качестве эксплантата.

Существует много методов клонального микроразмножения, и различными авторами предлагаются разные системы их классификации. (рис 1.)

Рис. 1. Схема микроклонального размножения растений: 1 — активация развития меристемы; 2 — образование адвентивных почек непосредственно на первичном экспланте; 3 — индукция соматического эмбриогенеза в каллусе и суспензионной культуре; 4 — образование адвентивных почек в каллусной ткани: а — получение стерильной культуры; б — формирование микропобегов и развитие соматических эмбриоидов; в — укоренеие микропобегов и образование искусственных семян; г — перевод растений–регенерантов в тепличные условия с последующей высадкой в поле. [3]

Соматический эмбриогенез широко используется в качестве важного биотехнологического инструмента для устойчивого клонального размножения. Это процесс, при котором соматические клетки или ткани развиваются в дифференцированные эмбрионы. Эти соматические зародыши могут развиваться в целые растения, не подвергаясь процессу полового оплодотворения, как это происходит у зиготических зародышей. Соматический эмбриогенез может быть инициирован непосредственно из эксплантатов или косвенно путем создания массы неорганизованных клеток, называемых каллусом. Регенерация растений посредством соматического эмбриогенеза происходит путем индукции эмбриогенных культур из зиготических семян, листьев или сегментов стебля и дальнейшего размножения эмбрионов. Затем зрелые зародыши культивируются для прорастания и развития проростков и, наконец, переносятся в почву.

В настоящее время способность выращивать клетки растений и ткани в культуре и контролировать их развитие составляет основу многих практических приложений в сельском хозяйстве, промышленной химии, садоводства и является предпосылкой для генной инженерии растений. Культура клеток, тканей и органов растений теперь считается основной техникой для понимания общих или специфических биологических функций растительного мира, и это одна из самых гибких основ морфологических, физиологических и молекулярно-биологических применений растений.

Сегодня культура тканей в значительной степени интегрирована в биотехнологию и позволяет регенерировать растения в виде клонов и трансгенов.

Таким образом, каллусные и клеточные суспензии становятся менее важными в качестве исходного материала для определенных ферментов и химических веществ. Изменение целей требует изменения способа обработки культуры растительных тканей.

Основные термины (генерируются автоматически): соматический эмбриогенез, культура тканей, ткань, клетка, питательная среда, культура тканей растений, орган растений, Организация лаборатории, растение.