Какое оборудование помогло бы сократить время на посев образцов и время инкубации

Добавил пользователь Алексей Ф.
Обновлено: 05.09.2024

В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 "О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений" подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения.

При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии, что и является большим минусом этого метода. Только при идеальном выполнении всех требуемых условий, указанных в Приказе № 109 МЗ РФ,-исследование не менее трех проб диагностического материала, правильный сбор мокроты, наличие современного бинокулярного микроскопа и высококачественных реактивов, просмотр до 300 полей зрения - возможно повышение чувствительности до 10000 микробных клеток.

Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.

К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.

При гистологическом или цитологическом исследовании иногда можно обнаружить характерные для туберкулёза клетки, являющиеся результатом защитной реакции организма на внедрение туберкулёзной палочки. Наличие в цитограмме гигантских клеток Лангханса с несомненностью решает диагноз туберкулёза. Эти клетки имеют очень большие размеры (80 - 90 мкм и более в диаметре). Цитоплазма окрашена в серо-голубой цвет. По её периферии расположено в ряд большое количество ядер (до 20), расположенных в форме кольца (рисунок 1, в).

Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).

Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.

Рисунок 1

Микобактерии туберкулеза
а - метод окраски по Цилю-Нельсену
б - метод люминисцентной микроскопии
в - клетки Лангхаса
г - эпителиоидные клетки

Культуральный метод

Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, "Новая", Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4 - 8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.

Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды, способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.

Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.

Основным недостатком культуральной диагностики туберкулеза является длительность исследования - от трех недель до трех месяцев. Поэтому остаются актуальными дальнейшие исследования по разработке методов ускорения роста микобактерий.

Системы BACTEC

Культуральная диагностика туберкулеза переживает в настоящее время принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику полностью автоматизированных систем культивирования МБТ. Главное отличие этих методов - применение жидких питательных сред для культивирования с последующей радиометрической (BACTEC 460), колорометрической (Mb-Bact, Вас- tALERT) и люминесцентной детекцией роста (BACTEC MGIT 960). Рост МБТ на жидкой питательной среде в этих системах удается обнаружить уже через 1 - 2 недели в зависимости от их исходного количества в диагностическом материале. Частота выявления микобактерий так же несколько выше, чем на плотных питательных средах. Автоматизированные системы BACTEC с использованием соответствующих флаконов, содержащих различные противотуберкулезные препараты, позволяют сократить время исследования лекарственной устойчивости микобактерий до 10 - 14 суток.

Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, "погашенный" высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и "вручную", тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.

Основным недостатком BACTEC MGIT, как и других систем BACTEC, является высокая стоимость оборудования (до 100000 долларов США) и флаконов с питательной средой - посев одной пробы диагностического материала стоит до 400 рублей.

Посев на L -формы микобактерий

Так называемые дефектные по клеточной стенке L-формы микобактерий и других инфекционных патогенов являются результатом изменчивости и основным видом персистирования, то есть переживания в неблагоприятных условиях. Посев на L-формы особенно эффективен при внелегочном туберкулезе, поскольку вегетация МБТ в очагах ВЛТ при повышенном ацидозе и анаэробиозе приводит к снижению их жизнеспособности и ферментативной активности.

Диагноз не может быть поставлен только на основании выявления L-форм микобактерий, но их обнаружение, особенно при верификации методом ПЦР, является весомым аргументом в пользу туберкулезной природы заболевания. В очагах внелегочного туберкулеза наблюдается ранняя L-трансформация микобактерий, поэтому их обнаружение позволяет поставить диагноз на начальных стадиях заболевания.

В Москве сократили срок лечения больных коронавирусом. Уже с 6 февраля режим самоизоляции можно прекратить после семи дней с момента подтверждения диагноза COVID-19. Об этом заявили в оперштабе. Также в Москве отменили карантин в школьных классах и группах детсадов. Очные занятия возобновятся уже на следующей неделе. На карантин будут уходить, только если в классе из-за болезни отсутствуют больше 20% учеников. И еще, санитарно-эпидемиологические правила обновил Роспотребнадзор. Отменяется карантин для тех, кто контактировал с ковидными больными, а заболевших, которые находятся на лечении дольше семи дней, будут выписывать без контрольного ПЦР-теста.

Врачи и вирусологи внимательно изучают "омикрон". Как показывают наблюдения, инкубационный период данного вариант коронавируса – максимум трое суток. Заболевание развивается очень быстро и так же быстро уходит. По этой причине Роспотребнадзор разрешил выписывать переболевших COVID-19 без отрицательного теста на коронавирус, если лечение пациента длилось неделю или дольше.

"Выделение вируса тоже существенно сократилось. И буквально в первый день может оно начинаться, а в течение нескольких дней уже завершиться. И поэтому такие пациенты быстро становятся неопасными для окружающих, фактически даже быстрее, чем будут получены результаты тестирования", – пояснила заместитель директора ФБУН МНИИЭМ имени Габричевского Роспотребнадзора, доктор медицинских наук Татьяна Руженцова.

Изучался не только российский, но и международный опыт. Подобные правила вводятся во многих странах. Это прежде всего помогает снизить нагрузку на первичное звено здравоохранения и избежать лишних, ненужных тестов.

"Исследования российских и зарубежных ученых показывают, что люди, прошедшие вакцинацию, и особенно повторную, или бустерную вакцинацию, защищены от тяжелого течения COVID-19. Поэтому мы рекомендуем всем пройти вакцинацию и ревакцинацию через шесть месяцев, чтобы защититься от неблагоприятного течения COVID-19", – отметила главный внештатный специалист по терапии и общей врачебной практике Минздрава России, член-корреспондент РАН Оксана Драпкина.

Этим же постановлением глава Роспотребнадзора отменила обязательный карантин для контактировавших с больными. Соблюдать изоляцию им тоже больше не нужно.

Бывает, что пациенты выздоравливают намного быстрее. И такие случаи тоже описаны в постановлении. Тогда нужно будет сдавать повторный тест и дождаться, чтобы отрицательный тест был сдан как минимум через три дня после положительного. Тогда возвращаться в трудовой коллектив уже можно, даже если прошло меньше недели.

При этом специалисты отмечают, что значительная часть населения в России либо вакцинирована, либо переболела коронавирусом ранее, потому "омикрон" переносится легче.

"Сократился вообще период наблюдения за пациентами. И во главу угла в настоящий момент ставится самочувствие пациента. И вот, собственно, Роспотребнадзор регламентирует следующую позицию: для лиц, которые контактировали, в настоящий момент нет необходимости находиться в изоляции на протяжении 7, а раньше 14 дней. И ключевым моментом для того, чтобы индивидуум приступил к трудовой деятельности, к обучению, является самочувствие", – уточнил заместитель директора по научной работе ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, председатель Национального научного общества инфекционистов, член-корреспондент РАН Александр Горелов.

Новые правила вступают в силу уже в это воскресенье. Как оформление больничных, так и выписку пациентов будут основывать на новых требованиях.

"Врачи смогут быстрее оказать помощь тем пациентам, кому действительно нужна помощь. Новый порядок оформления больничных листов, принятый для заботы о людях, будет действовать до 15 марта", – предупредил главный внештатный специалист по инфекционным болезням Минздрава России, профессор Владимир Чуланов.

Впрочем, важно не путать: при наличии выраженных симптомов болезни сокращать карантин больному никто не станет.

8.1. Техника посева и выделения чистых культур микроорганизмов

Доставляемый в лабораторию материал подвергают бакте­риологическому исследованию в тот же день. Техника посева зависит от характера засеваемого материала, консистенции пи­тательной среды и цели исследования.

Для проведения посевов необходимы: подлежащий исследо­ванию материал, питательные среды, бактериологическая пет­ля, шпатели (стеклянные, металлические), пастеровские и градуированные пипетки, металлические кюветы или поднос для переноса засеянных чашек и металлические коробки для пере­носа пробирок, ведро или бачок с крышками для сброса отра­ботанного инфицированного материала, спиртовая или газовая горелка.

Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку – "зеркало". Пипетками пользу­ются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме.

Способ взятия плотного материала определяется его кон­систенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериоло­гической петлей.

Все манипуляции, связанные с посевом и выделением мик­робных культур, производят над пламенем горелки. Бактери­альную петлю перед взятием материала прокаливают в пламени горелки, затем ее остужают так, чтобы при соприкосновении с жидкой средой она не вызывала кипения жидкости, а при­косновение к агару не сопровождалось его плавлением. Для остуживания петли лучше всего погружать ее в конденсацион­ную жидкость пробирки со стерильной питательной средой или прикасаться к крышке чашки Петри со стерильной средой. Нельзя остужать петлю прикосновением к поверхности пи­тательной среды, даже свободной от микробного роста, так как на ней могут находиться колонии, не видимые простым глазом.

После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся в ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала.

Пипетки и шпатели, использованные для посевов, опускают в дезинфицирующий раствор.

После посева на чашках Петри со стороны дна, на пробир­ках – в верхней трети надписывают название засеянного ма­териала или ставят номер анализа и дату посевов.

8.1.1. Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды

• При посеве в жидкую питательную среду петлю с находя­щимся на ней материалом погружают в среду. Если мате­риал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.
• При посеве на скошенный мясопептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой IV и V пальцами, не прикасаясь к той ее части, которая входит внутрь пробирки. Остальные три пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериологической петли, посредством которой произво­дится посев. Петлю держат, как писчее перо. После выни­мания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее по­сторонних микроорганизмов из воздуха.

При посеве на скошенный агар петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опус­кают плашмя на поверхность питательной среды и скользящи­ми движениями наносят штрихи снизу вверх от одной стенки пробирки к другой (рис. 8.1).

• • При посеве на поверхность плотной питательной среды из пробирки в чашки Петри пробирку фиксируют II, III и V пальцами левой руки, а крышку чашки Петри приоткрыва­ют I и IV пальцами левой руки настолько, чтобы в образо­вавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель (рис. 8.2). Небольшое количество исследуемого материала, взятого из пробирки бактериологической петлей, втирают в поверхность питательной среды у края чашки. Затем пет­лю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериологическую пет­лю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поца­рапать ее поверхность, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на 4, 8 или 16 равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые пет­лей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов в концевой ее части.
• • Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользовать­ся вместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной сре­ды. Такой характер микробного роста получил название сплошного или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одно­го вида.

• Для посева материала в толщу плотной питательной среды готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изо­тоническом растворе. Набирают 0,1–1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного за­грязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15–20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40– 45 "С (при такой температуре пробирка со средой, прило­женная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в пи­тательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вра­щают по поверхности стола.
• Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней матери­алом.
• Калиброванной бактериологической петлей (диаметр 2 мм, емкость 0,005 мл) производят посев мочи на сектор А чаш­ки Петри с простым агаром, сделав около 40 штрихов. Затем петлю прожигают и производят 4 штриховых посе­ва из сектора А в сектор I, из сектора I в сектор II и из сек­тора II в сектор III, каждый раз после прожигания петли (рис. 8.3).

Чашки инкубируют при температуре 37 °С в течение 18– 24 ч, после чего подсчитывают количество колоний, выросших в разных секторах, и определяют количество бактерий в 1,0 мл по приведенной табл. 8.1 (этот метод принят для определения степени бактериурии).

Таблица 8.1. Определение количества бактерий в 1 мл методом секторных посевов*

Количество колоний в секторах

Количество бактерий в 1 мл

*Приказ № 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологи­ческих (бактериологических) методов исследования, применяемых в кли­нико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учрежде­ний" (Москва, 1985).

8.1.2. Методы выделения чистых культур

Чистой культурой принято называть совокупность однород­ных микроорганизмов, относящихся к одному виду, полученных из массы одной колонии, клетки которой идентичны по морфологическим, тинкториальным, культуральным, метабо­лическим и генетическим признакам, так как по существующим представлениям микробная колония является популяцией бактериальных клеток, возникшей в результате размножения единственной материнской клетки. Микробная колония являются аналогом клона.

Чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделен­ные из различных источников, могут отличаться друг от друга незначительным отклонением морфологических, культуральных или биохимических признаков, не выходя за пределы своего вида или подвида. Такие культуры называют штаммами. Вместо ранее именованных типов в зависимости от характера изменившегося признака их обозначают морфоварами (отлич­ные по морфологическим признакам), сероварами (имеющие антигенные отличия), биоварами (отличающиеся биологичес­кими свойствами).

Чистая культура необходима для изучения морфологичес­ких, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение полу­чил метод механического разъединения микроорганизмов, на­ходящихся в исследуемом материале, с целью получения изо­лированных колоний на поверхности или в глубине питатель­ной среды. Очень широко применяются селективные питатель­ные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воз­действию определенных факторов внешней среды. Индивиду­альная устойчивость микробов к тому или иному фактору была использована для разработки методов выделения чистых куль­тур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отличие от остальных мик­робов, содержащихся в мокроте.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней мик­рофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных жи­вотных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологичес­кий метод выделения чистой культуры применяется при иссле­довании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43–45 °С. В пробирку вносят одну бактериологическую петлю исследуе­мого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого одну петлю (прокаленную и остуженную) содержимого 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам про­бирок.

После застудневания среды с исследуемым материалом чаш­ки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Рас­плавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливного роста. В пер­вую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте­рильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового ма­териала, шпатель переносят во 2-ю, а затем и 3-ю чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чис­той культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют парал­лельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посе­ва материал, находящийся в петле, расходуется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Выращивание и выделение чистых культур анаэробов. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные ус­ловия, сущность которых заключается в удалении молекуляр­ного кислорода из питательной среды и пространства, окружа­ющего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспе­чивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удале­ния растворенного кислорода является кипячение. Непосред­ственно перед посевом материала пробирки с питательными Средами кипятят на водяной бане в течение 10–20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, уда­ляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду бы­стро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воз­духа, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху сте­рильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1–1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки.

В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, ас­корбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глутатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приго­товление питательной среды Китта – Тароцци (рецепт 161), широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Для создания бескислородных условий используют физи­ческие, химические и биологические факторы.

Физические способы культивирования анаэробов:

• • способ Виньяля – Вейона. Берут 4–5 пробирок с 0,5 % рас­плавленным и охлажденным до температуры 40–45 °С са­харным агаром. В содержимое одной из них вносят пипет­кой небольшое количество исследуемого материала и тща­тельно размешивают. Для уменьшения концентрации мате­риала с целью получения изолированных колоний засеян­ную среду в количестве, соответствующем объему внесен­ного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют ка­пилляры трех пастеровских пипеток.

Чтобы предупредить застывание питательной среды в мо­мент насасывания ее в пипетки, пока их кончик не обломлен, пипетки погружают на 3–5 мин в стерильную воду с темпера­турой 45–50 °С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2–3 сут в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изо­лировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микро­ба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду;

• • выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные усло­вия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Пет­ри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, затем присоединяют его к насосу и выкачива­ют воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуум­ных условиях растут на поверхности плотной питательной среды.

Химические методы выращивания анаэробов (метод Аристовского). Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидро­сульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор закры­вают крышкой и помещают в термостат при температуре 37 *С на 24–48 ч.

Биологический метод выращивания анаэробов (по Фортнеру). В чашку Петри наливают толстым слоем 5 % кровяной агар с 1–2 % глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вы­резают стерильным скальпелем канавку шириной 1–1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину – культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палоч­кой (Escherichia coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрыва­ют, а свободное пространство между дном и крышкой закле­ивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстро растущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

Анаэростат для культивирования анаэробов. Анаэростат – прибор для выращивания микробов в анаэробных условиях – представляет собой толстостенную металлическую или пласти­ковую камеру с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. Вместо кислорода в нем используются газо­вые смеси.

Биологический контроль осуществляется на всех этапах: до, во время и после инкубации .

Для оценки качества условий выведения молодника и режима инкубации, необходимо собирать сведения о качестве инкубационного яйца и условиях его прозводства, хранения, транспортирования. Учитываются такие показатели, как количество боя яиц во время упаковки, транспортировки и укладки в лотки, количество яиц, непригодных для инкубации и др. Важны данные по видам брака непригодных для инкубации яиц.

В промышленном птицеводстве используют приемы биологического контроля:

• оценку яиц до инкубации;
• прижизненную оценку развития зародыша;
• вскрытие яиц с погибшими эмбрионами;
• оценку качества суточного молодняка.
  

В период инкубации необходимо вести учет продолжительности инкубационного периода, так как чаще всего с нарушением развития зародыша удлиняются сроки инкубации и растягивается вывод.

Вскрытие яйца с живым зародышем позволяет непосредственно видеть, как он растет, как развиваются его оболочки, используются белок и желток.

Анализ динамики смертности зародышей отражает основные нарушения в их развитии и причины массовой гибели. Вскрытие яиц с мертвыми зародышами и самих зародышей позволяет определить, по специфическим внешним признакам, причины нарушений развития зародышей и их гибели.

К тем или иным приемам прибегают только по мере необходимости. При высоком проценте вывода молодняка большинство приемов контроля исключают.

1. Биологический контроль до инкубации.

Оценка качества инкубационных яиц позволяет судить о физиологическом состоянии родительского стада, условиях кормления и содержания птицы. Контроль качества яиц включает:

1. Визуальную оценку по внешнему виду и при просвечивании яиц с сортировкой по качеству и разделением на: стандартные (без дефектов), условный брак (с одним незначительным дефектом) и явный брак (непригодные к инкубации).
2. Выборочный контроль пробы из партии яиц по морфологическим, физико-химическим и биохимическим показателям.

До инкубации применяются приемы биологического контроля:

• внешний вид яиц (размеры, чистота и качество скорлупы, однородность по форме и величине);
• масса яиц;
• овоскопирование яиц (исследование внутренней структуры яйца, подвижности желтка и интенсивности его окраски); просвечиваемости скорлупы, наличию включений в белке и желтке, состоянию зародышевого диска;
• вскрытие яиц (индекс белка и желтка, цвет желтка, оплодотворенность зародышевых дисков).
  

Если в целом качество яиц удовлетворяет требованиям, то детальную оценку дают только 5-10% общего количества инкубируемых яиц.

Вскрытое и вылитое

Вскрытое и вылитое

Стандартные инкубационные яйца должны иметь:

• правильную форму;
• чистую и гладкую скорлупу;
• воздушную камеру в тупом конце яйца или чуть смещенную в сторону (диаметр ее в свежем курином яйце не превышает 1,5 см.);
• желток занимает центральное положение или немного смещен к воздушной камере, малоподвижен при вращении яйца.

К условному браку относят яйца с:

Непригодными к инкубации следует считать яйца, у которых одновременно имеется несколько дефектов.

К явному браку относят яйца:

• очень мелкие или крупные,
• двух- или трехжелтковые,
• асимметричные или уродливые по форме,
• с большой или подвижной камерой,
• битые,
• с насечкой,
• с шероховатой хрупкой скорлупой,
• бесскорлупные,
• при наличии различных включений (кровяные, мясные, плесень),
• с оторванными градинками,
• разлитым желтком,
• загрязненные пометом, слизью, кровью.

При оценке яиц по внешнему виду и при просвечивании на овоскопе учитывают размер и форму яиц, состояние скорлупы, размеры и положение воздушной камеры, наличие трещин (насечка, бой) в скорлупе, различного рода включения в яйцах, положение и подвижность желтка, состояние градинок.

Яйца не пригодные

2. Биологический контроль во время инкубации.

Еженедельное контролирование развития эмбрионов в инкубируемых яйцах - это оперативная информация о проблемах в кормлении родительского стада и в нарушениях режимов инкубации.

Контроль в процессе инкубации включает:

1. Прижизненную оценку развития эмбрионов в контрольные дни овоскопированием яиц;
2. Учет эмбриональной смертности по периодам инкубации;
3. Учет потери массы яиц путем их взвешивания в контрольные дни.
4. Вскрытие яиц с живыми зародышами для оценки степени их развития (при необходимости).
5. Учет продолжительности инкубации и интенсивности вылупления.

2.1. Овоскопирование.

Основной прием "неразрушаюшего" биологического контроля во время инкубации - овоскопирование (просвечивание яиц), позволяет:

• оценить рост и развитие эмбриона, и его оболочку;
• проследить, как используются зародышем белок и желток;
• установить количество неоплодотворенных яиц;
• выявить яйца с мертвыми зародышами (тухляки) и примерные сроки их гибели.

Во время инкубации основной прием "неразрушающего" биологического контроля — овоскопирование яиц. Сроки овоскопирования яиц птицы разных видов приведены в таблице ниже.

Первое овоскопирование.

Оценивается состояние живых зародышей по расположению в яйце кровеносных сосудов и величине воздушной камеры.

Второе овоскопирование.

Признак хорошего развития - замыкание аллантоиса на остром конце яйца.

на 7-ой день инкубации.

на 12-ой день инкубации.

на 20-ой день инкубации.

Яйца с мертвыми зародышами погибшими

во время инкубации

Третье овоскопирование.

Хорошо развивающийся зародыш цыпленка занимает примерно 2/3 яйца, воздушная камера большая, ее границы волнисты и подвижны. Малая воздушная камера и отсутствие движений эмбриона - признак погибшего зародыша.

2.2. Взвешивание яиц.

Простой, но эффективный прием контроля — учет потери яйцами влаги. Для этого периодически взвешивают яйца:

• перед закладкой в инкубатор;
• на 7-е сутки инкубации;
• на 12-е сутки инкубации;
• на 19-е сутки инкубации.

В норме за 19 сут. инкубации куриные яйца теряют 12-13 % первоначальной массы.

2.3. Определение возраста эмбриона.

Во время эмбрионального развития между зародышем, желтком, белком и скорлупой происходит постоянный обмен веществ, особенности которого изменяются с возрастом. Эмбрион ассимилирует питательные вещества, выделяет и частично резервирует в нем продукты диссимиляции, поглощает и выделяет тепло. При этом изменяются строение, внешний вид и размеры эмбриона.

У эмбрионов появляются и временные (провизорные) органы, находящиеся вне его тела и функционирующие только до вывода из яйца. Их называют эмбриональными оболочками. Между стенками аллантоиса накапливаются продукты обмена веществ. После вывода остаются части скорлупы и неиспользованные подскорлупные оболочки, аллантоис, амнион.

Самая наружная внезародышевая оболочка, примыкающая к скорлупе и поэтому служащая местом обмена между зародышем и окружающей его средой, называется Хорионом . Основная функция хориона — осуществление дыхательного газообмена.

Полость между хорионом и амнионом – хорионамниотическая .

Аллантоис (от греч. "колбасовидный") — эмбриональный орган дыхания высших позвоночных животных; зародышевая оболочка, развивающаяся из задней кишки эмбриона. Кроме того, аллантоис участвует в газообмене зародыша с окружающей средой и выделении жидких отходов. У яйцекладущих птиц и рептилий аллантоис развивается вокруг эмбриона вдоль стенок скорлупы. В своём внешнем слое, называемым мезодермой, он создаёт разветвлённую сеть кровеносных сосудов, с помощью которых происходит взаимодействие с внешней средой.

Аллантоис, вкупе с другими эмбриональными оболочками — амнионом и хорионом, является определящим признаком высших позвоночных животных — млекопитающих, птиц и рептилий.

В основу определения возраста эмбрионов взято развитие тех или иных органов и временных эмбриональных оболочек. использование белка и желтка, амниотической жидкости, готовность к вылуплению и т.д. В процессе эмбриогенеза происходит потребление всех питательных веществ яйца – белка и желтка.

Посев различных бактерий представляет собой один из наиболее эффективных и широко распространенных способов, который в настоящее время активно применяется в сфере медицинской микробиологии. Также данный метод незаменим в области биотехнологии, где он играет важную роль в изучении различных свойств как биологического, так и биохимического характера. Под данным методом подразумевается процесс культивирования микроскопических организмов с использованием питательных сред, различающихся между собой по характеристикам и свойствам.

Бактериологические посевы могут проводиться с целью тщательного исследования отделяемых клеток глаз, половых органов человека, а также с целью максимально точного анализа крови, мочи или кала. Также выполняются бактериальные посевы спермы и мокроты для исследования. Довольно часто встречается процедура посева на анаэробные бактерии.

Какими бывают среды для питания бактерий

При выборе среды для осуществления посева в первую очередь следует ориентироваться на характер содержания, присущего бактериям, которые являются главным объектом исследования. В том случае, если необходимо получить изолированные колонии бактерий, а также определить чистую культуру, следует выполнять посев на плотные питательные среды.

Но если материал, подверженный исследованию, содержит в себе не очень большое количество микроорганизмов, можно в этих целях использовать жидкую питательную среду.

Существует несколько разновидностей питательных сред, в которых осуществляется бактериальный посев. Итак, принято различать простые и специальные среды, а также элективные и дифференциально-диагностические. Каждая категория сред питания отличается своими индивидуальными особенностями и характеристиками.

Простые питательные среды, в свою очередь, бывают как плотными, так и жидкими. В первом случае это мясопептонный агар, а во втором – мясопептонный бульон.

Главной особенностью специальных сред является абсолютная замена основы либо смешивание ее с другим компонентом, обладающим специфическими свойствами и характеристиками. В результате такого процесса можно выделить следующие виды питательных сред:

• агар на основе сыворотки;
• агар на основе казеина и активированного угля;
• яичная среда, открытая бактериологами Леванштейном и Йенсеном;
• бульон на основе агара и стерильной дефибринированной крови кролика, лошади или барана.

Известны в микробиологии и элективные питательные среды, отличительной чертой которых является получение роста только того из микроорганизмов, который на данный момент представляет интерес для исследования.

К элективным средам относят:

• пептонную воду;
• щелочной агар;
• среду Мюллера;
• среду Леффлера;
• желточно-солевой агар;
• селенитовую среду.

С целью исследования сальмонелл бактерии высеиваются на селенитовую среду и среду Мюллера. Наиболее эффективной для работы с коринебактериями дифтерии признана питательная среда Леффлера. Для стафилококка бактерии высеивать необходимо на желточно-солевой агар, а для холерного вибриона – в пептонную воду.

При помощи дифференциально-диагностических питательных сред появляется возможность проведения максимально точной идентификации отдельно взятых категорий, групп и типов бактерий. Среди данных сред можно выделить два основных типа – это:

Какие различают способы и техники посева

Принято различать несколько техник и методов посева. В большинстве случае данный процесс осуществляется при помощи специальных микробиологических петель. При посеве на специальные чашки Петри данный процесс происходит с применением особых игл или шпателей, изготовленных из стекла или металла. Такой инструмент, как бактериальная петля, можно с уверенностью назвать универсальным, поскольку он применяется в разных техниках бактериального посева. В случае с жидкими материалами применяют специальную петлю в сочетании с пипетками – пастеровскими или градуированными.

Инструмент под названием чашка Петри предназначен специально для осуществления посева на плотные питательные среды. Это выполненный в форме невысокого и плоского цилиндра лабораторный сосуд, изобретенный в 1877 году знаменитым немецким бактериологом Юлиусом Ризардом Петри, который являлся ассистентом микробиолога Роберта Коха. Для изготовления чашки Петри, как правило, используют стекло либо полистирол с прозрачной текстурой. Самый широко используемый размер чашки Петри – высота до 15 миллиметров и диаметр от 50 до 100 миллиметров.

В данном случае техника бактериального посева такова: немного приоткрывают крышку чашки Петри, а затем наносят на поверхность плотной питательной среды – агара – требуемое количество посевного материала.

После того как произойдет инкубация бакпосева, бактерии начнут расти густо и равномерно, превращаясь в полноценную культуру и подразделяясь на отдельные колонии.

В данном процессе можно использоваться как стеклянные, так и пластмассовые чашки Петри. Первый вид предназначается для многоразового, а второй – для одноразового применения. Пластиковые чашки Петри являются стерильными, а поставляют их в специальных надежных герметических упаковках. Стеклянные сосуды, в свою очередь, требуют тщательной стерилизации перед осуществлением каждого нового посева.

Если при бакпосеве на плотные среды применяются чашки Петри, то в случае с жидкими средами можно использовать пробирки. Бактериальный посев позволяет быстро вырастить культуру бактерий с определенными свойствами и характеристиками.

Особенности бактериального посева мочи

Анализ, подразумевающий бактериальный посев мочи, предназначается для выявления, идентификации различных микроорганизмов, а также позволяет определить точную их концентрацию. Чтобы провести данную процедуру, мочу, которая является в данном случае основным биоматериалом, помещают в специальную среду питания, которая окажется для нее максимально благоприятной. Если после этого микроорганизмы не начнут расти, результат анализа является отрицательным.

Если же после проведения такого анализа концентрация микроорганизмов в моче окажется достаточно высокой для их размножения, то его результат, бесспорно, положителен.

В каких случаях пациентам назначают анализ мочи с посевом бактерий?

Проведение анализа с бактериальным посевом мочи является актуальным в нескольких случаях:

• при наличии инфекционных заболеваний органов мочевыводящей системы;
• при заболевании сахарным диабетом;
• при беременности;
• с целью уточнения диагноза, если заболевание носит нетипичный характер.

Для проведения этого вида анализа требуется утренняя порция мочи пациента, приблизительное количество которой составляет от трех до пяти миллилитров. Перед сбором мочи на анализ пациент должен обязательно провести соответствующие гигиенические процедуры, однако применять при этом средства с антисептическими свойствами нельзя. Доставку собранной мочи для анализа необходимо производить в кратчайшие сроки. С этой целью применяется стерильный одноразовый контейнер, который гарантирует правильную транспортировку и максимально точные результаты.

Образование высшее филологическое. В копирайтинге с 2012 г., также занимаюсь редактированием/размещением статей. Увлечения — психология и кулинария.

Читайте также:

  
• Отвар лаврового листа для месячных при задержке рецепт через сколь влияет
  
• Способы посева зерновых культур
  
• Исландский мак посадка и уход
  
• Нолина уход в домашних условиях
  
• Как выбрать сухую картошку