Изолированные протопласты растений их получение и культивирование

Добавил пользователь Валентин П.
Обновлено: 19.09.2024

Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Протопласт имеет характерную сферическую форму, его поверхность защищена только плазмолеммой.

Изоляция протопластов

Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:
- невысокая производительность;
- возможность использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом;
- трудоемкость и длительность.

Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 г. Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 г. Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.

По сравнению с механическим энзиматический метод обладает следующими преимуществами:
- одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн из грамма ткани или клеток);
- клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу;
- клетки не повреждаются;
- метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы.

Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.

Выделение протопластов проводят в три этапа:
1) обработка ферментами;
2) выделение протопластов из клеточных стенок;
3) отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

В зависимости от происхождения растения и взятой для изоляции протопластов ткани подбирается вид ферментов, их комбинация и концентрация. Для выделения протопластов используют разные ткани растения, а также каллусные и суспензионные культуры. С целью получения большого числа однотипных протопластов у двудольных используют мезофилл молодых листьев.

Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl2, KCl) в концентрации 0,3-0,8 моль/л. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.

Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды - 5,4-5,8, температура - 22-28 оС, невысокая освещенность (не более 2 000 лк).

Общее представление об этапах получения, культивирования in vitro протопластов и регенерации из них растений дано на рис. 4.15.

Схема получения и культивирования протопластов из клеток растений


Рис. 4.15. Схема получения и культивирования протопластов из клеток растений

Тотипотентность протопластов

Сразу после того, как отмыты ферменты, протопласты начинают регенерировать клеточную стенку. Отмечается появление целлюлозных микрофибрилл, постепенно организующихся в типичную клеточную оболочку. Через 2-4 дня протопласт может утратить сферическую форму, и произойдет полное восстановление клеточной стенки. В зависимости от происхождения протопластов и культуральных условий может отмечаться отсутствие синтеза клеточной оболочки в течение нескольких недель или месяцев.

Одним из факторов культуральной среды, обусловливающим синтез клеточной стенки, является сахароза. В ее отсутствие синтеза клеточной стенки не происходит.

Протопласты, не регенерировавшие клеточную стенку, теряют способность к нормальному митотическому делению и образованию клеточных колоний. Такие протопласты или не приступают к делению, или в результате их деления формируются многоядерные структуры, так как кариокинез не сопровождается цитокинезом.

Формирование клеточной стенки не всегда является условием, достаточным для перехода клетки к делению. В зависимости от объекта и условий культивирования к последующему делению может приступить от 0,1 до 80 % восстановивших клеточную стенку протопластов. Первые деления могут происходить через 2-10 дней с начала культивирования протопластов. Образовавшиеся клеточные колонии могут стать источником растенийрегенерантов.

Рефераты и конспекты лекций по географии, физике, химии, истории, биологии. Универсальная подготовка к ЕГЭ, ГИА, ЗНО и ДПА!

Изолированный протопласт - это растительная клетка, лишенная клеточной стенки ферментативным или механическим способом.

Культура изолированных протопластов это один из самых современных методов, который используется в генетике, физиологии, вирусологии и молекулярной биологии для получения соматических гибридов между удаленными в систематическом отношении видами или при половой несовместимости, для получения новых форм растений путем введения в клетку чужеродного генома или его части .

Отсутствие оболочки облегчает поступление в клетку различных физиологически активных веществ и позволяет наблюдать за первичной реакцией клетки на воздействие этих веществ, исследовать метаболизм в контролируемых условиях. Так как в изолированных протопластов сразу начинается регенерация клеточной оболочки, то они очень удобным объектом для изучения формирования целлюлозных микрофибрилл.

Протопласты высших растений можно получать механическим и / или ферментативным методом.

Впервые протопласты были выделены Клеркером в 1892 году при изучении плазмолиза из тканей листа водного растения телорез (Stratiotes aloides). Он сначала плазмолизував растительные ткани, а затем удалял клеточную стенку. Таким методом можно выделить протопласты с эпидермиса лука (в 0,1 М растворе сахарозы). Если после плазмолиза разрезать лезвием полоску эпидермиса, то протопласты будут выходить в среду, содержащего осмотическое стабилизатор. Такой метод выделения протопластов называются механическим или физическим.

Несмотря на модификации и усовершенствования механический метод и сегодня имеет определенные ограничения:

1) этим методом можно выделить только небольшое количество протопластов;

2) используются только те ткани, в которых происходит интенсивное плазмолиз, т.е. те которые имеют вакуолизирован клетки паренхимных типа;

3) метод длительный и трудоемкий, а потому сейчас используется очень редко.

Сегодня широко применяется ферментативный или химический метод выделения изолированных протопластов. В этом случае для разрушения клеточной стенки используются смеси ферментов. К первым работам по ферментативному выделению протопластов можно отнести опыты, в которых протопласты клеток гриба были изолированы в результате обработки клеточных стенок желудочным соком улитки Helix pomatia (1919).

Впервые протопласты из клеток высших растений энзиматическим методом выделил Кокинг в 1960 году. Он выделил протопласты из корешков проростков томатов, обрабатывая их гидролитическим ферментом (целлюлазой) с культуральной жидкости плесневых грибов Myrothecium verrucaria.

Ферментативный способ имеет большие преимущества, потому что он дает возможность получать значительные количества неповрежденных протопластов из любого органа или ткани, и сравнительно быстрый.

На сегодня протопласты получают из однодольных и двудольных растений, используя листья, побеги, колеоптиль, клубни, плоды, пыльца, каллусных культур. Для выделения протопластов, как правило, используют молодые растения. Предпочтение отдается растениям, которые выросли в стерильных условиях in vitro. В исследованиях ряда авторов (Хромова и др., 1984; Chaoxi et al., 1987; MC Tan et al., 1987) показано, что на жизнеспособность изолированных протопластов, и их способность к регенерации клеточной стенки, к разделов, образования микроколоний влияет физиологический состояние исходного материала, который определяется условиями культивирования. Кроме того, от физиологического состояния исходного материала зависела способность ткани к мацерации. Наилучшие результаты были получены при выращивании растений на среде с пониженным содержанием сахарозы (0,5%) и затмении растений перед выделением протопластов. Или при выращивании исходных растений при низкой интенсивности света (1500 - 2000 Лк) и коротком фотопериода (6 г). Исследователи объясняют увеличение количества жизнеспособных протопластов тем, что при слабом освещении или в среде с низким содержанием сахарозы резко снижается интенсивность фотосинтеза, в результате чего уменьшается содержание свободных сахаров и клетки синтезируют тонкую клеточную стенку, которая содержит меньше пектина. Относительно значения или влияния выращивания исходного материала при низких плюсовых температурах на выход изолированных протопластов, то данные противоположны: MC Tan (1987) отмечает увеличение количества изолированных протопластов при таких условиях, тогда как Хромова с сотр. (1984) отмечают, что снижение температуры в период культивирования исходных растений не приводило к повышению эффективности процесса получения жизнеспособных протопластов, активно делятся.

При выделении протопластов из культуры тканей (Калюс или клеточная суспензия) необходимо учитывать:

1) возраст исходной ткани в цикле выращивания: лучше использовать ткань, которая находится на стадии раннего экспоненциального роста, когда в популяции значительное количество клеток, которые способны начать разделение;

2) особенности роста ткани - для выделения протопластов лучше использовать рыхлую, недифференцированную ткань, которая образует небольшие агрегаты клеток при культивировании в жидкой среде.

Важное значение для успешного выделения жизнеспособных, нативных протопластов имеет подбор осмотического стабилизатора. С наличием клеточной стенки у растительной клетки связана регуляция ее водообмена. Как известно, сосущие силу формируют не только осмотические свойства клетки, но и тургорного давление. С увеличением количества воды в клетке возрастает тургорного давление и, соответственно, уменьшается ее сосущая сила. Процесс поступления воды в клетку прекращается полностью, когда тургорного давление становится равным осмотическому давлению. Таким образом, структурная организация клетки, которая включает протопласт и клеточную стенку, формирует саморегуляторные механизмы водообмена.

Поэтому для изолированных протопластов, лишенных клеточной стенки особое, очень важное значение имеют осмотические свойства среды выделения и культивирования. Как осмотические стабилизаторы используют сахара - глюкозу, сахарозу, маннит, сорбит, ксилозу и иногда ионные осмотикы - растворы солей Са02, KCl, Na2HPÜ4. Маннит используют чаще, чем сорбит так как он имеет слабую проникающую способность в клетки, проникновение в клетки сорбита сопровождается и проникновением ферментов. Используют смесь маннита и сорбита. Использование в ферментных системах растворов глюкозы и сахарозы создает условия близки к условиям культивирования, хотя эти сахара активно проникают через мембрану. В тех случаях, когда использование сахаров не дает хороших результатов, как осмотические стабилизаторы используют растворы солей. Хотя известно, что соли имеют большую проникающую способность, чем сахара, и снижают активность некоторых гидролитических ферментов. Растворы макро-и микросолей часто берут за основу которой добавляют другие физиологически активные вещества. Это смягчает процесс выделения протопластов. Особенно когда он длительный, и приближает его к условиям культивирования ткани в суспензии. Неправильный выбор осмотического агента может привести к разрыву плазмалемме или вызвать спонтанное слияния протопластов и образование многоядерных клеток. Оптимальным для выделения протопластов является 0,3 - 0,8 М растворы.

Для ферментативного разрушения клеточной стенки используют препараты трех типов - целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназу, получаемых из культур разных грибов (Myrothecium verrucaria, Trichoderma viride, Aspergillus и др.), а также пищеварительного сока улитки Helix pomatia. Чаще всего используют целюлазни препараты "Onozuka", "Driselase" и препараты пектиназу - "Macerozyme", "Pectinase" или "Pectinol". Действие этих ферментов направлена на разрушение основных компонентов клеточной стенки. У растений это целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества. Целлюлозные молекулы, которые собраны в микрофибрилл, формируют рыхлый, но крепкий структурный остов. Он погружен в аморфный матрикс, состоящий из гемицеллюлозы, пектиновых веществ и белков.

В первичной клеточной стенке на долю целлюлозы приходится до 30% от сухой массы и столько же на пектиновые вещества, 40% составляют гемицеллюлозы. Эти соотношения могут варьировать в клетках разных типов ткани зависимости от функциональных особенностей, возраста, наличия вторичных утолщений. Поэтому комбинации ферментных препаратов и их соотношение специфичны для каждого типа клеток. Так для получения протопластов из ткани плодов, которые обычно имеют высокое содержание пектина, особенно подходит пектиназу. Тогда как, при выделении протопластов с мезофилы листа следует использовать смесь пектиназу и целлюлазы - фермента, разрушающего целлюлозные компоненты клеточной стенки.

Оптимальные условия для выделения протопластов очень индивидуальны для разных тканей, а потому в каждом случае необходимо подбирать состав смеси ферментов, их концентрации и соотношения, а также продолжительность обработки. Выделенные протопласты должны контактировать с ферментом минимальное время, а затем их нужно тщательно отмыть.

Время выделения протопластов зависит от концентрации фермента. При больших концентрациях продолжительность инкубации составляет 1 - 4 ч, при невысоких -12 - 20 ч, оптимальные условия рН 5 - 6, температура 23 - 26 ° С. Иногда необходимо слабое покачивание течение инкубации с ферментом.

Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще в конце прошлого века. Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как в 1960 г. И. К. Коккинг впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты.

В настоящее время продолжается разработка и совершенствование методов выделения и культивирования протопластов на искусственных питательных средах. Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаС12.

В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На формирование колоний протопластами влияет состав питательной среды. Дальнейшая задача – получение из каллусной ткани растений-реге-нерантов. Пока не удалось получить регенеранты из протопластов многих злаковых (пшеницы, ячменя). Однако успешно осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты) и других культур.

Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и целлюлозой.

Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но довольно редко. Индуцированное слияние изолированных протопластов впервые было получено в лаборатории Коккинга в 1970 г. его сотрудниками Пауэром и др. В качестве индуктора они использовали нитрат натрия. Но этот метод оказался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким рН (9–11) и высокой концентрацией ионов кальция (100–300 мМ). Протопласты предварительно агглютинируют с помощью концентрированных растворов полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500–6000. У. Циммерман с сотрудниками. разработали физический метод слияния протопластов животных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использовались импульсы электрического тока.

Слияние протопластов приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного. Это возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер, и одно ядро дегенерирует. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облучения.

Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несущие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам.

Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca и N. Langsdorfii.

В настоящее время методом парасексуальной гибридизации получено большое число межвидовых, межсемейственных и межтрибных гибридов. Однако во многих случаях гибридные растения, полученные таким путем, в той или иной степени ненормальны. Примером может служить соматический гибрид между арабидопсисом и турнепсом, который является растением-монстром. Возникающие аномалии являются результатом хромосомной несбалансированности (Ю. Ю. Глеба, 1982).

Особый интерес представляют межцарственные клеточные гибриды, полученные от слияния протопластов растительных и животных клеток. Описаны гибриды между протопластами эритроцитов крысы и протопластами дрожжевых клеток, между протопластами моркови и человека, табака и человека и др.

При соматической гибридизации эксперимент строится аналогично опытам по генетике микроорганизмов. Иными словами, используются большие популяции клеток обоих родителей. При обработке смешанной суспензии протопластов фьюзогенами часть из них сливается друг с другом, но в суспензии остаются и неслившиеся протопласты. Все они, включая гибридные, вдальнейшем регенерируют клеточные стенки и переходят к делениям. Возникает задача – выделить из общей массы гибридные экземпляры. Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими методами.

Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селективных маркеров использовались зеленые хлоропласты табака и красно-оранжевые хромопласты моркови.

Другим методом, позволяющим производить отбор гибридов, является генетическая комплементация. Этот метод был применен для обнаружения гибридов табака, при этом использовались хлорофиллдефектные мутации у родителей с последующей комплементацией в гибридных продуктах. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светоза-висимую хлорофилльную недостаточность. Растения, гомозиготные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. После слияния и регенерации клеточные колонии пересаживают на среду, индуцирующую стеблевой органогенез, и культивируют на свету.




Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразумевают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия. Например, половые гибриды между N. glauca и N. Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов в условиях in vitro способны расти и размножаться на питательных средах без гормонов. Гормононезависимость клеток гибрида и была положена в основу метода селекции. После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти в этих условиях. Существуют также другие методы селекции соматических гибридов: смешанная физиологогенетическая комплементация, физическое обогащение (метод основан на разделении протопластов при центрифугировании в связи с их различной плотностью), механическая изоляция.

Использование изолированных протопластов в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоропласты. Из этих протопластов Карлсон получил растения-регенеранты, содержащие хлоропласты другого организма.

Однако работы по переносу чужеродных органелл и ДНК только начинают развиваться. В целом использование изолированных протопластов в генетической реконструкции клетки, как мы видим, открывает богатые перспективы перед клеточной селекцией.

Введение микроорганизмов в изолированные протопласты

Партнеры создаваемых ассоциаций. С целью получения ассоциаций внутриклеточного типа предпринимались неоднократные попытки вводить микроорганизмы в изолированные протопласты разных видов высших растений, среди которых представлены злаковые и другие сельскохозяйственные культуры, не имеющие естественных симбионтов. Протопласты выделяют из тканей растений или клеток суспензионных культур ферментативным способом.

В изолированные протопласты растений вводили микроорганизмы разных систематических групп: бактерии, дрожжи, цианобактерии (прежнее их название - синезеленые водоросли), органеллы (называемые цианеллами) водоросли Glaucocystis nostochinearum и криптомонадоподобного простейшего Суапорпоra paradoxa. Цианеллы представляют собой эндосимбиотические цианобактерии с отсутствующей или редуцированной клеточной стенкой. Используемые в экспериментах микроорганизмы отличались своими метаболическими возможностями. Зеленые водоросли, все цианобактерии и цианеллы осуществляют фотосинтез; бактерии R. leguminosarum, A. brasilense, цианобактерии Gloeocapsa, A. variabilis и N. macrozamia - азотфиксаторы.

Протопласты растений - это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды, характери­зующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять ак­тивный метаболизм и выполнять биосинтезы и трансформацию энергии. Термин был использован Д. Ханстеином в 1880 г. для обозначения мор­фологически обособленных образований при плазмолизе. Впервые выде­ление растительных протопластов было осуществлено в 1892 г. Дж. Клеркером.

Наиболее простыми, но длительными и трудоемкими методами полу­чения растительных протопластов являются механические. При этом фрагмент растительной ткани вносят в 0,1 М раствор сахарозы, более концентрированный, чем вакуолярный сок, выдерживают определенное время до тех пор, пока протопласты не сожмутся и не отойдут от клеточ­ных стенок, а затем аккуратно рассекают эпидермис, и протопласты вы­ходят в среду. Однако при применении даже модифицированных меха­нических методов можно получить только ограниченное число прото­пластов и в этом случае использовать только те ткани, в которых возмо­жен экстенсивный плазмолиз (получить протопласты из меристемы или зрелой ткани очень сложно).

Принципиально отличный метод получения изолированных прото­пластов - энзиматический. В этом случае для удаления клеточной стенки используются ферменты. Изолирование протопластов из клеток высших растений с использованием ферментов впервые было успешно осуществ­лено Е. Кокингом в 1960 г. Он удачно применил ферментный препарат из культуральной жидкости гриба Myrothecium verrucaria для получения больших количеств изолированных протопластов из кончиков корней томатов.

В сравнении с механическим методом ферментативное выделение протопластов имеет определенные преимущества: 1) одновременно можно получить большое количество протопластов; 2) протопласты не подвергаются сильному осмотическому сжатию; 3) клетки более интакт ны и не повреждены; 4) метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используются ферментные препара­ты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы - чаще всего грибного или бактериального происхождения. Выбор ферментной сис­темы производится на основании знаний об особенностях растительных тканей. В результате обработки тканей ферментными препаратами обра­зуется смесь, содержащая протопласты, обломки разрушенных клеток и целые клетки. Чтобы отделить протопласты от примесей, суспензию фильтруют через нейлоновые фильтры, а затем подвергают центрифуги­рованию в мягких условиях.

Источником клеток для получения протопластов помимо фрагментов растительных тканей являются также клеточные суспензии и каллусные культуры.

Выделение протопластов достаточно легко выполнимая и техниче­ски хорошо отработанная процедура, однако сложно получить жизне­способные протопласты и также непросто их в дальнейшем культиви­ровать. Успех процесса зависит от многих факторов - состава фермен­тов, их качества, рН среды, выбора осмотического раствора. Большое значение при этом имеет состояние растительного материала, а имен­но, его видовая, генетическая, энергетическая и физиологическая ха­рактеристики, а также применяемые методы получения и культивиро­вания протопластов.

Для стабильного получения большого количества протопластов важ­ны стандартные условия выращивания исходных растений или клеток, определение оптимального для выделения протопластов возраста расте­ния или органа, температуры, освещения, питания.

Для получения протопластов из суспензионных клеточных культур наилучшей является поздняя логарифмическая фаза роста, когда клеточ­ные стенки лучше всего поддаются ферментативному разрушению, а протопласты наиболее жизнеспособны.

Культивирование растительных протопластов

Для культивирования протопластов можно использовать метод жид­ких капель (К. Као и др., 1971). В этом случае суспензия протопластов в виде капель в жидкой среде помещается в пластиковые чашки Петри. Метод обеспечивает хороший газообмен через воздушную фазу и диф­фузию в раствор экскретируемых продуктов. Кроме того, легко можно добавлять свежий раствор в нужной концентрации. Однако при культи­вировании этим способом протопласты агрегируются в центре каждой капли. Накапливаясь, они образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений, что препятствует дальнейшему ус­пешному культивированию. Этот метод также неудобен, если требуется исследовать развитие индивидуальной колонии протопластов.




Другой широко распространенный метод - агаровая культура (T. Нагата, И. Такебе, 1971). В этом случае определенный объем суспен­зии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же самой среды, содержащей 1 % агар-агара. Температура не должна превышать 45 о С. Чашки заклеи­вают парафиллюмом и культивируют при температуре около 28 о С. Про­топласты фиксированы в одном положении и физически отдалены один от другого. Этот метод имеет важное преимущество: можно наблюдать для одного конкретного протопласта все этапы его развития - формиро­вание клеточной стенки, деление клеток, рост и развитие растения. Не­достаток этого метода заключается в том, что возможно некоторое по­вреждение протопластов при смешивании с теплым агар-агаром.

Сходным с этим методом является метод совместных культур. Он используется для эффективного культивирования труднокультивируемых протопластов. Такие протопласты культивируются совместно с протопластами, отличающимися быстрым ростом. Успех такого культи­вирования основан на активных веществах, которые выделяются быстро­растущими видами.

Удобным вариантом метода жидких капель является культивирова­ние в малом объеме (до 1 мкл) единичных протопластов (микроизоля­ция). В микрокаплях, даже если в них находится только одна клетка, со­отношение объема клетки к объему питательной среды такое же, как в культуре плотностью около 1000 клеток/мл.

По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками. Поэтому питательные среды подобны таковым для клеточных культур. Наиболее часто используют среды Мурасиге - Скуга, модифицированную среду Нагата - Такебе, среду В 5 Гамборга - Эве- лейта, и среду 8Р Као - Мичайлук, представляющую собой обогащенную витаминами, аминокислотами и сахарами среду В5 Гамборга. Все эти среды содержат минеральные вещества, являющиеся источниками мак­ро- и микроэлементов, источники углерода, стабилизаторы осмотическо­го давления, витамины, фитогормоны.

Поскольку центральная проблема при культивировании раститель­ных объектов на искусственных питательных средах - создание опреде­ленной буферной емкости смеси, то обычно используют сопряженные пары солей, в которые объединяют химически и физиологически кислые и щелочные соли. К основным сопряженным парам относятся соли, со­держащие азот и фосфор. Среды содержат железо в хелатной форме и сахарозу как источник углерода.

Рекомендуется добавлять в среду сахара, входящие в состав клеточ­ной стенки, а также ксилозу, рибозу и другие. Это стимулирует образо­вание клеточной стенки. Состав этих добавок может быть очень специ­фичным в зависимости от видовых особенностей протопластов. Для ин­дукции деления протопластов многих видов растений эффективно до­бавлять в среду ауксины - 2,4-Д, НУК, БАП, а также цитокинины - кинетин, зеатин, бензиладенин.

Температура культивирования является в значительной степени видоспецифичной и варьирует в достаточно широких пределах. При куль­тивировании растительных протопластов температурный режим должен строго выдерживаться, т. к. обычно протопласты чувствительны даже к незначительным отклонениям от оптимальной температуры. То же каса­ется и интенсивности освещенности. Оптимальные значения освещенно­сти могут варьировать от абсолютной темноты до яркого света.

Существенным фактором культивирования является плотность засева протопластов. При очень низкой плотности протопласты часто не делят­ся, в то время как при очень высокой плотности возникают затруднения на поздних этапах культивирования из-за появления в ростовой среде токсичных продуктов обмена. Оптимальная плотность протопластов в культуре составляет 10 -10 кл/мл.

Таким образом, используя разнообразные методы, учитывая харак­терные особенности исходного материала и соблюдая все условия, мож­но успешное осуществить культивирование растительных протопластов, добиваясь в отдельных случаях получения целого растения из единич­ных протопластов.

Детальная разработка техники культивирования растительных кле­ток, получения и культивирования растительных протопластов послужи­ла основой для создания методов биологического конструирования рас­тений с заданными свойствами.

Читайте также: