Изолированные протопласты растений их получение и культивирование
Добавил пользователь Валентин П. Обновлено: 19.09.2024
Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Протопласт имеет характерную сферическую форму, его поверхность защищена только плазмолеммой.
Изоляция протопластов
Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:
- невысокая производительность;
- возможность использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом;
- трудоемкость и длительность.
Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 г. Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 г. Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.
По сравнению с механическим энзиматический метод обладает следующими преимуществами:
- одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн из грамма ткани или клеток);
- клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу;
- клетки не повреждаются;
- метод сравнительно быстрый.
Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы.
Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.
Выделение протопластов проводят в три этапа:
1) обработка ферментами;
2) выделение протопластов из клеточных стенок;
3) отделение интактных протопластов от клеточных осколков.
В зависимости от происхождения растения и взятой для изоляции протопластов ткани подбирается вид ферментов, их комбинация и концентрация. Для выделения протопластов используют разные ткани растения, а также каллусные и суспензионные культуры. С целью получения большого числа однотипных протопластов у двудольных используют мезофилл молодых листьев.
Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl2, KCl) в концентрации 0,3-0,8 моль/л. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.
Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.
Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды - 5,4-5,8, температура - 22-28 оС, невысокая освещенность (не более 2 000 лк).
Общее представление об этапах получения, культивирования in vitro протопластов и регенерации из них растений дано на рис. 4.15.
Рис. 4.15. Схема получения и культивирования протопластов из клеток растений
Тотипотентность протопластов
Сразу после того, как отмыты ферменты, протопласты начинают регенерировать клеточную стенку. Отмечается появление целлюлозных микрофибрилл, постепенно организующихся в типичную клеточную оболочку. Через 2-4 дня протопласт может утратить сферическую форму, и произойдет полное восстановление клеточной стенки. В зависимости от происхождения протопластов и культуральных условий может отмечаться отсутствие синтеза клеточной оболочки в течение нескольких недель или месяцев.
Одним из факторов культуральной среды, обусловливающим синтез клеточной стенки, является сахароза. В ее отсутствие синтеза клеточной стенки не происходит.
Протопласты, не регенерировавшие клеточную стенку, теряют способность к нормальному митотическому делению и образованию клеточных колоний. Такие протопласты или не приступают к делению, или в результате их деления формируются многоядерные структуры, так как кариокинез не сопровождается цитокинезом.
Формирование клеточной стенки не всегда является условием, достаточным для перехода клетки к делению. В зависимости от объекта и условий культивирования к последующему делению может приступить от 0,1 до 80 % восстановивших клеточную стенку протопластов. Первые деления могут происходить через 2-10 дней с начала культивирования протопластов. Образовавшиеся клеточные колонии могут стать источником растенийрегенерантов.
Рефераты и конспекты лекций по географии, физике, химии, истории, биологии. Универсальная подготовка к ЕГЭ, ГИА, ЗНО и ДПА!
Изолированный протопласт - это растительная клетка, лишенная клеточной стенки ферментативным или механическим способом.
Культура изолированных протопластов это один из самых современных методов, который используется в генетике, физиологии, вирусологии и молекулярной биологии для получения соматических гибридов между удаленными в систематическом отношении видами или при половой несовместимости, для получения новых форм растений путем введения в клетку чужеродного генома или его части .
Отсутствие оболочки облегчает поступление в клетку различных физиологически активных веществ и позволяет наблюдать за первичной реакцией клетки на воздействие этих веществ, исследовать метаболизм в контролируемых условиях. Так как в изолированных протопластов сразу начинается регенерация клеточной оболочки, то они очень удобным объектом для изучения формирования целлюлозных микрофибрилл.
Протопласты высших растений можно получать механическим и / или ферментативным методом.
Впервые протопласты были выделены Клеркером в 1892 году при изучении плазмолиза из тканей листа водного растения телорез (Stratiotes aloides). Он сначала плазмолизував растительные ткани, а затем удалял клеточную стенку. Таким методом можно выделить протопласты с эпидермиса лука (в 0,1 М растворе сахарозы). Если после плазмолиза разрезать лезвием полоску эпидермиса, то протопласты будут выходить в среду, содержащего осмотическое стабилизатор. Такой метод выделения протопластов называются механическим или физическим.
Несмотря на модификации и усовершенствования механический метод и сегодня имеет определенные ограничения:
1) этим методом можно выделить только небольшое количество протопластов;
2) используются только те ткани, в которых происходит интенсивное плазмолиз, т.е. те которые имеют вакуолизирован клетки паренхимных типа;
3) метод длительный и трудоемкий, а потому сейчас используется очень редко.
Сегодня широко применяется ферментативный или химический метод выделения изолированных протопластов. В этом случае для разрушения клеточной стенки используются смеси ферментов. К первым работам по ферментативному выделению протопластов можно отнести опыты, в которых протопласты клеток гриба были изолированы в результате обработки клеточных стенок желудочным соком улитки Helix pomatia (1919).
Впервые протопласты из клеток высших растений энзиматическим методом выделил Кокинг в 1960 году. Он выделил протопласты из корешков проростков томатов, обрабатывая их гидролитическим ферментом (целлюлазой) с культуральной жидкости плесневых грибов Myrothecium verrucaria.
Ферментативный способ имеет большие преимущества, потому что он дает возможность получать значительные количества неповрежденных протопластов из любого органа или ткани, и сравнительно быстрый.
На сегодня протопласты получают из однодольных и двудольных растений, используя листья, побеги, колеоптиль, клубни, плоды, пыльца, каллусных культур. Для выделения протопластов, как правило, используют молодые растения. Предпочтение отдается растениям, которые выросли в стерильных условиях in vitro. В исследованиях ряда авторов (Хромова и др., 1984; Chaoxi et al., 1987; MC Tan et al., 1987) показано, что на жизнеспособность изолированных протопластов, и их способность к регенерации клеточной стенки, к разделов, образования микроколоний влияет физиологический состояние исходного материала, который определяется условиями культивирования. Кроме того, от физиологического состояния исходного материала зависела способность ткани к мацерации. Наилучшие результаты были получены при выращивании растений на среде с пониженным содержанием сахарозы (0,5%) и затмении растений перед выделением протопластов. Или при выращивании исходных растений при низкой интенсивности света (1500 - 2000 Лк) и коротком фотопериода (6 г). Исследователи объясняют увеличение количества жизнеспособных протопластов тем, что при слабом освещении или в среде с низким содержанием сахарозы резко снижается интенсивность фотосинтеза, в результате чего уменьшается содержание свободных сахаров и клетки синтезируют тонкую клеточную стенку, которая содержит меньше пектина. Относительно значения или влияния выращивания исходного материала при низких плюсовых температурах на выход изолированных протопластов, то данные противоположны: MC Tan (1987) отмечает увеличение количества изолированных протопластов при таких условиях, тогда как Хромова с сотр. (1984) отмечают, что снижение температуры в период культивирования исходных растений не приводило к повышению эффективности процесса получения жизнеспособных протопластов, активно делятся.
При выделении протопластов из культуры тканей (Калюс или клеточная суспензия) необходимо учитывать:
1) возраст исходной ткани в цикле выращивания: лучше использовать ткань, которая находится на стадии раннего экспоненциального роста, когда в популяции значительное количество клеток, которые способны начать разделение;
2) особенности роста ткани - для выделения протопластов лучше использовать рыхлую, недифференцированную ткань, которая образует небольшие агрегаты клеток при культивировании в жидкой среде.
Важное значение для успешного выделения жизнеспособных, нативных протопластов имеет подбор осмотического стабилизатора. С наличием клеточной стенки у растительной клетки связана регуляция ее водообмена. Как известно, сосущие силу формируют не только осмотические свойства клетки, но и тургорного давление. С увеличением количества воды в клетке возрастает тургорного давление и, соответственно, уменьшается ее сосущая сила. Процесс поступления воды в клетку прекращается полностью, когда тургорного давление становится равным осмотическому давлению. Таким образом, структурная организация клетки, которая включает протопласт и клеточную стенку, формирует саморегуляторные механизмы водообмена.
Поэтому для изолированных протопластов, лишенных клеточной стенки особое, очень важное значение имеют осмотические свойства среды выделения и культивирования. Как осмотические стабилизаторы используют сахара - глюкозу, сахарозу, маннит, сорбит, ксилозу и иногда ионные осмотикы - растворы солей Са02, KCl, Na2HPÜ4. Маннит используют чаще, чем сорбит так как он имеет слабую проникающую способность в клетки, проникновение в клетки сорбита сопровождается и проникновением ферментов. Используют смесь маннита и сорбита. Использование в ферментных системах растворов глюкозы и сахарозы создает условия близки к условиям культивирования, хотя эти сахара активно проникают через мембрану. В тех случаях, когда использование сахаров не дает хороших результатов, как осмотические стабилизаторы используют растворы солей. Хотя известно, что соли имеют большую проникающую способность, чем сахара, и снижают активность некоторых гидролитических ферментов. Растворы макро-и микросолей часто берут за основу которой добавляют другие физиологически активные вещества. Это смягчает процесс выделения протопластов. Особенно когда он длительный, и приближает его к условиям культивирования ткани в суспензии. Неправильный выбор осмотического агента может привести к разрыву плазмалемме или вызвать спонтанное слияния протопластов и образование многоядерных клеток. Оптимальным для выделения протопластов является 0,3 - 0,8 М растворы.
Для ферментативного разрушения клеточной стенки используют препараты трех типов - целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназу, получаемых из культур разных грибов (Myrothecium verrucaria, Trichoderma viride, Aspergillus и др.), а также пищеварительного сока улитки Helix pomatia. Чаще всего используют целюлазни препараты "Onozuka", "Driselase" и препараты пектиназу - "Macerozyme", "Pectinase" или "Pectinol". Действие этих ферментов направлена на разрушение основных компонентов клеточной стенки. У растений это целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества. Целлюлозные молекулы, которые собраны в микрофибрилл, формируют рыхлый, но крепкий структурный остов. Он погружен в аморфный матрикс, состоящий из гемицеллюлозы, пектиновых веществ и белков.
В первичной клеточной стенке на долю целлюлозы приходится до 30% от сухой массы и столько же на пектиновые вещества, 40% составляют гемицеллюлозы. Эти соотношения могут варьировать в клетках разных типов ткани зависимости от функциональных особенностей, возраста, наличия вторичных утолщений. Поэтому комбинации ферментных препаратов и их соотношение специфичны для каждого типа клеток. Так для получения протопластов из ткани плодов, которые обычно имеют высокое содержание пектина, особенно подходит пектиназу. Тогда как, при выделении протопластов с мезофилы листа следует использовать смесь пектиназу и целлюлазы - фермента, разрушающего целлюлозные компоненты клеточной стенки.
Оптимальные условия для выделения протопластов очень индивидуальны для разных тканей, а потому в каждом случае необходимо подбирать состав смеси ферментов, их концентрации и соотношения, а также продолжительность обработки. Выделенные протопласты должны контактировать с ферментом минимальное время, а затем их нужно тщательно отмыть.
Время выделения протопластов зависит от концентрации фермента. При больших концентрациях продолжительность инкубации составляет 1 - 4 ч, при невысоких -12 - 20 ч, оптимальные условия рН 5 - 6, температура 23 - 26 ° С. Иногда необходимо слабое покачивание течение инкубации с ферментом.
Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще в конце прошлого века. Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как в 1960 г. И. К. Коккинг впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты.
В настоящее время продолжается разработка и совершенствование методов выделения и культивирования протопластов на искусственных питательных средах. Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаС12.
В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На формирование колоний протопластами влияет состав питательной среды. Дальнейшая задача – получение из каллусной ткани растений-реге-нерантов. Пока не удалось получить регенеранты из протопластов многих злаковых (пшеницы, ячменя). Однако успешно осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты) и других культур.
Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и целлюлозой.
Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но довольно редко. Индуцированное слияние изолированных протопластов впервые было получено в лаборатории Коккинга в 1970 г. его сотрудниками Пауэром и др. В качестве индуктора они использовали нитрат натрия. Но этот метод оказался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким рН (9–11) и высокой концентрацией ионов кальция (100–300 мМ). Протопласты предварительно агглютинируют с помощью концентрированных растворов полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500–6000. У. Циммерман с сотрудниками. разработали физический метод слияния протопластов животных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использовались импульсы электрического тока.
Слияние протопластов приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного. Это возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер, и одно ядро дегенерирует. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облучения.
Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несущие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам.
Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca и N. Langsdorfii.
В настоящее время методом парасексуальной гибридизации получено большое число межвидовых, межсемейственных и межтрибных гибридов. Однако во многих случаях гибридные растения, полученные таким путем, в той или иной степени ненормальны. Примером может служить соматический гибрид между арабидопсисом и турнепсом, который является растением-монстром. Возникающие аномалии являются результатом хромосомной несбалансированности (Ю. Ю. Глеба, 1982).
Особый интерес представляют межцарственные клеточные гибриды, полученные от слияния протопластов растительных и животных клеток. Описаны гибриды между протопластами эритроцитов крысы и протопластами дрожжевых клеток, между протопластами моркови и человека, табака и человека и др.
При соматической гибридизации эксперимент строится аналогично опытам по генетике микроорганизмов. Иными словами, используются большие популяции клеток обоих родителей. При обработке смешанной суспензии протопластов фьюзогенами часть из них сливается друг с другом, но в суспензии остаются и неслившиеся протопласты. Все они, включая гибридные, вдальнейшем регенерируют клеточные стенки и переходят к делениям. Возникает задача – выделить из общей массы гибридные экземпляры. Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими методами.
Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селективных маркеров использовались зеленые хлоропласты табака и красно-оранжевые хромопласты моркови.
Другим методом, позволяющим производить отбор гибридов, является генетическая комплементация. Этот метод был применен для обнаружения гибридов табака, при этом использовались хлорофиллдефектные мутации у родителей с последующей комплементацией в гибридных продуктах. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светоза-висимую хлорофилльную недостаточность. Растения, гомозиготные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. После слияния и регенерации клеточные колонии пересаживают на среду, индуцирующую стеблевой органогенез, и культивируют на свету.
Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразумевают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия. Например, половые гибриды между N. glauca и N. Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов в условиях in vitro способны расти и размножаться на питательных средах без гормонов. Гормононезависимость клеток гибрида и была положена в основу метода селекции. После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти в этих условиях. Существуют также другие методы селекции соматических гибридов: смешанная физиологогенетическая комплементация, физическое обогащение (метод основан на разделении протопластов при центрифугировании в связи с их различной плотностью), механическая изоляция.
Использование изолированных протопластов в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоропласты. Из этих протопластов Карлсон получил растения-регенеранты, содержащие хлоропласты другого организма.
Однако работы по переносу чужеродных органелл и ДНК только начинают развиваться. В целом использование изолированных протопластов в генетической реконструкции клетки, как мы видим, открывает богатые перспективы перед клеточной селекцией.
Введение микроорганизмов в изолированные протопласты
Партнеры создаваемых ассоциаций. С целью получения ассоциаций внутриклеточного типа предпринимались неоднократные попытки вводить микроорганизмы в изолированные протопласты разных видов высших растений, среди которых представлены злаковые и другие сельскохозяйственные культуры, не имеющие естественных симбионтов. Протопласты выделяют из тканей растений или клеток суспензионных культур ферментативным способом.
В изолированные протопласты растений вводили микроорганизмы разных систематических групп: бактерии, дрожжи, цианобактерии (прежнее их название - синезеленые водоросли), органеллы (называемые цианеллами) водоросли Glaucocystis nostochinearum и криптомонадоподобного простейшего Суапорпоra paradoxa. Цианеллы представляют собой эндосимбиотические цианобактерии с отсутствующей или редуцированной клеточной стенкой. Используемые в экспериментах микроорганизмы отличались своими метаболическими возможностями. Зеленые водоросли, все цианобактерии и цианеллы осуществляют фотосинтез; бактерии R. leguminosarum, A. brasilense, цианобактерии Gloeocapsa, A. variabilis и N. macrozamia - азотфиксаторы.
Протопласты растений - это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды, характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм и выполнять биосинтезы и трансформацию энергии. Термин был использован Д. Ханстеином в 1880 г. для обозначения морфологически обособленных образований при плазмолизе. Впервые выделение растительных протопластов было осуществлено в 1892 г. Дж. Клеркером.
Наиболее простыми, но длительными и трудоемкими методами получения растительных протопластов являются механические. При этом фрагмент растительной ткани вносят в 0,1 М раствор сахарозы, более концентрированный, чем вакуолярный сок, выдерживают определенное время до тех пор, пока протопласты не сожмутся и не отойдут от клеточных стенок, а затем аккуратно рассекают эпидермис, и протопласты выходят в среду. Однако при применении даже модифицированных механических методов можно получить только ограниченное число протопластов и в этом случае использовать только те ткани, в которых возможен экстенсивный плазмолиз (получить протопласты из меристемы или зрелой ткани очень сложно).
Принципиально отличный метод получения изолированных протопластов - энзиматический. В этом случае для удаления клеточной стенки используются ферменты. Изолирование протопластов из клеток высших растений с использованием ферментов впервые было успешно осуществлено Е. Кокингом в 1960 г. Он удачно применил ферментный препарат из культуральной жидкости гриба Myrothecium verrucaria для получения больших количеств изолированных протопластов из кончиков корней томатов.
В сравнении с механическим методом ферментативное выделение протопластов имеет определенные преимущества: 1) одновременно можно получить большое количество протопластов; 2) протопласты не подвергаются сильному осмотическому сжатию; 3) клетки более интакт ны и не повреждены; 4) метод сравнительно быстрый.
Для удаления клеточной стенки используются ферментные препараты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы - чаще всего грибного или бактериального происхождения. Выбор ферментной системы производится на основании знаний об особенностях растительных тканей. В результате обработки тканей ферментными препаратами образуется смесь, содержащая протопласты, обломки разрушенных клеток и целые клетки. Чтобы отделить протопласты от примесей, суспензию фильтруют через нейлоновые фильтры, а затем подвергают центрифугированию в мягких условиях.
Источником клеток для получения протопластов помимо фрагментов растительных тканей являются также клеточные суспензии и каллусные культуры.
Выделение протопластов достаточно легко выполнимая и технически хорошо отработанная процедура, однако сложно получить жизнеспособные протопласты и также непросто их в дальнейшем культивировать. Успех процесса зависит от многих факторов - состава ферментов, их качества, рН среды, выбора осмотического раствора. Большое значение при этом имеет состояние растительного материала, а именно, его видовая, генетическая, энергетическая и физиологическая характеристики, а также применяемые методы получения и культивирования протопластов.
Для стабильного получения большого количества протопластов важны стандартные условия выращивания исходных растений или клеток, определение оптимального для выделения протопластов возраста растения или органа, температуры, освещения, питания.
Для получения протопластов из суспензионных клеточных культур наилучшей является поздняя логарифмическая фаза роста, когда клеточные стенки лучше всего поддаются ферментативному разрушению, а протопласты наиболее жизнеспособны.
Культивирование растительных протопластов
Для культивирования протопластов можно использовать метод жидких капель (К. Као и др., 1971). В этом случае суспензия протопластов в виде капель в жидкой среде помещается в пластиковые чашки Петри. Метод обеспечивает хороший газообмен через воздушную фазу и диффузию в раствор экскретируемых продуктов. Кроме того, легко можно добавлять свежий раствор в нужной концентрации. Однако при культивировании этим способом протопласты агрегируются в центре каждой капли. Накапливаясь, они образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений, что препятствует дальнейшему успешному культивированию. Этот метод также неудобен, если требуется исследовать развитие индивидуальной колонии протопластов.
Другой широко распространенный метод - агаровая культура (T. Нагата, И. Такебе, 1971). В этом случае определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же самой среды, содержащей 1 % агар-агара. Температура не должна превышать 45 о С. Чашки заклеивают парафиллюмом и культивируют при температуре около 28 о С. Протопласты фиксированы в одном положении и физически отдалены один от другого. Этот метод имеет важное преимущество: можно наблюдать для одного конкретного протопласта все этапы его развития - формирование клеточной стенки, деление клеток, рост и развитие растения. Недостаток этого метода заключается в том, что возможно некоторое повреждение протопластов при смешивании с теплым агар-агаром.
Сходным с этим методом является метод совместных культур. Он используется для эффективного культивирования труднокультивируемых протопластов. Такие протопласты культивируются совместно с протопластами, отличающимися быстрым ростом. Успех такого культивирования основан на активных веществах, которые выделяются быстрорастущими видами.
Удобным вариантом метода жидких капель является культивирование в малом объеме (до 1 мкл) единичных протопластов (микроизоляция). В микрокаплях, даже если в них находится только одна клетка, соотношение объема клетки к объему питательной среды такое же, как в культуре плотностью около 1000 клеток/мл.
По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками. Поэтому питательные среды подобны таковым для клеточных культур. Наиболее часто используют среды Мурасиге - Скуга, модифицированную среду Нагата - Такебе, среду В 5 Гамборга - Эве- лейта, и среду 8Р Као - Мичайлук, представляющую собой обогащенную витаминами, аминокислотами и сахарами среду В5 Гамборга. Все эти среды содержат минеральные вещества, являющиеся источниками макро- и микроэлементов, источники углерода, стабилизаторы осмотического давления, витамины, фитогормоны.
Поскольку центральная проблема при культивировании растительных объектов на искусственных питательных средах - создание определенной буферной емкости смеси, то обычно используют сопряженные пары солей, в которые объединяют химически и физиологически кислые и щелочные соли. К основным сопряженным парам относятся соли, содержащие азот и фосфор. Среды содержат железо в хелатной форме и сахарозу как источник углерода.
Рекомендуется добавлять в среду сахара, входящие в состав клеточной стенки, а также ксилозу, рибозу и другие. Это стимулирует образование клеточной стенки. Состав этих добавок может быть очень специфичным в зависимости от видовых особенностей протопластов. Для индукции деления протопластов многих видов растений эффективно добавлять в среду ауксины - 2,4-Д, НУК, БАП, а также цитокинины - кинетин, зеатин, бензиладенин.
Температура культивирования является в значительной степени видоспецифичной и варьирует в достаточно широких пределах. При культивировании растительных протопластов температурный режим должен строго выдерживаться, т. к. обычно протопласты чувствительны даже к незначительным отклонениям от оптимальной температуры. То же касается и интенсивности освещенности. Оптимальные значения освещенности могут варьировать от абсолютной темноты до яркого света.
Существенным фактором культивирования является плотность засева протопластов. При очень низкой плотности протопласты часто не делятся, в то время как при очень высокой плотности возникают затруднения на поздних этапах культивирования из-за появления в ростовой среде токсичных продуктов обмена. Оптимальная плотность протопластов в культуре составляет 10 -10 кл/мл.
Таким образом, используя разнообразные методы, учитывая характерные особенности исходного материала и соблюдая все условия, можно успешное осуществить культивирование растительных протопластов, добиваясь в отдельных случаях получения целого растения из единичных протопластов.
Детальная разработка техники культивирования растительных клеток, получения и культивирования растительных протопластов послужила основой для создания методов биологического конструирования растений с заданными свойствами.
Читайте также: