Что при клональном размножении растений in vitro имеет наиболее широкое распространение

Добавил пользователь Дмитрий К.
Обновлено: 19.09.2024

Микроклональное размножение и оздоровление растений

Методы микроклонального размножения

Методы клонального микроразмножения

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

1. Активация пазушных меристем.

2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.

3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.

4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.

5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.

6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Н. В. Катаева и Р. Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).

2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo :

а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;

б) индукция соматического эмбриогенеза;

в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений - активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования (рис. 18).

Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.

Рис. 18. Схема размножения растений методом активации уже существующих меристем (по А. Р. Родину, Е. А. Калашниковой, 1993): 1 – путем удаления верхушечной меристемы: 2 – добавлением цитокининов в среду (б/г – среда без гормонов, Ц – цитокинин, А – ауксин)

Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.

Часто в качестве экспланта используют верхушечные или пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами. Образующиеся пучки побегов делят, при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro (рис. 19), а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений (рис. 20).

Рис. 19. Образование корней побегами розы при добавлении в питательную среду 2 мг/л 2,4-Д

Рис. 20. Адаптация пробирочных роз к почвенным условиям

В настоящее время этот метод широко используется в производстве посадочного материала сельскохозяйственных культур, как технических, так и овощных, а также для размножения культур промышленного цветоводства (например, гвоздики, рис. 21), тропических и субтропических растений, плодовых и ягодных культур, древесных растений. Для некоторых культур, таких как картофель, технология клонального размножения поставлена на промышленную основу. Применение метода активации развития существующих меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 100000 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней - ценного безвирусного семенного материала.

Рис. 21. Пробирочная гвоздика

Второй метод - индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения. Можно добиться образования адвентивных почек почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковиц, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих цитокинины в соотношении с ауксинами 10:1 или 100:1. В качестве ауксина используют ИУК или НУК. Таким способом были размножены многие представители семейства лилейных, томаты, древесные растения (из зрелых и незрелых зародышей).

Достаточно хорошо разработана технология клонального размножения земляники, основанная на культивировании апикальных меристем. Меристематические верхушки изолируют из молодых, свободных от вирусных болезней растений, и выращивают на питательной среде МС, содержащей БАП в концентрации 0,1 - 0,5 мг/л. Через 3 - 4 недели культивирования меристема развивается в проросток, в основании которого формируются адвентивные почки, быстро растущие и дающие начало новым почкам. В течение 6-8 недель образуется конгломерат почек, связанных между собой соединительной тканью и находящихся на разной стадии развития. Появляются листья на коротких черешках, в нижней части которых формируются новые адвентивные почки. Эти почки разделяют и пересаживают на свежую питательную среду. На среде без регуляторов роста за 4 - 5 недель формируются нормальные растения с корнями и листьями. От одного материнского растения таким образом можно получить несколько миллионов растений-регенерантов в год.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему виду напоминают зиготические зародыши (рис. 22). Этот метод получил название соматического эмбриогенеза. В отличие от развития in vivo, соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию развития в проросток. На рисунке 3 показан конечный результат развития – растение пшеницы.

Рис. 22. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани

Наиболее впечатляющим применением метода соматического эмбриогенеза стало размножение гвинейской масличной пальмы (Elaeis guineensis), масло которой широко используется при производстве маргарина и пищевого масла. Масличная пальма в природе не образует побегов и боковых ростков, что затрудняет ее вегетативное размножение. Культивирование черенков in vitro также невозможно. Было решено получить скопления клеток недифференцированной ткани (каллусы) путем дедифференцировки специфических тканей, а затем культивировать их до регенерации целых проростков. В первой культуральной среде каллусы из фрагментов листьев развивались в течение 90 дней, при переносе во вторую и третью культуральные среды превращались в "эмбриоиды". Эмбриоиды размножались самопроизвольно, в течение месяца число эмбриоидов возрастало втрое, а за год из 10 эмбрионов можно было получить потомство численностью 500000 растений.

Формирование эмбриоидов в культуре тканей осуществляется в несколько этапов. Сначала происходит дифференциация клеток под влиянием ауксинов, добавленных в питательную среду (2,4-Д) и превращение их в эмбриональные. Получить эмбриоиды из этих клеток можно уменьшая концентрацию ауксинов или исключая их из питательной среды. Соматические зародыши представляют собой полностью сформированные зародыши, из которых путем соответствующего капсулирования можно получить искусственные семена.

Четвертый метод клонального микроразмножения - дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани (рис. 23).

Рис. 23. Дифференциация придаточных почек в каллусной ткани

Практически он мало используется с целью получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при частом пассировании каллусной ткани может изменяться плоидность регенерируемых растений, наблюдаются структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций. Наряду с генетическими изменениями отмечаются и морфологические: низкорослость, неправильное жилкование листьев, образование укороченных междоузлий, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. В то же время, некоторые недостатки этого метода в селекционной работе оборачиваются преимуществами.

Рис. 24. Формирование побегов каллусной тканью пшеницы

Кроме того, в некоторых случаях он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. Через каллусную культуру успешно размножаются сахарная свекла, злаковые (рис. 24), представители рода Brassica, подсолнечник и другие культуры.

Микроклональное размножение растений делится на два этапа – непосредственно размножение растительного материала in vitro (проводится в специализированной лаборатории) и последующая адаптация микроскопических растений (может проводиться любым желающим в домашних условиях).

В целом А.Д. эта технология очень нравится, в планах расширение набора выращиваемых меристемных культур и сортов и продолжение наблюдений. В частности, пока открыт вопрос, не изменяется ли скороплодность плодовых культур при микроклональном размножении. Также интересно посмотреть, будет ли влиять выращивание деревьев на своих корнях на вкусовые качества плодов (в трудах Бербанка и Мичурина есть сведения о положительном влиянии корнесобственности).

Структурной основой используемого на практике явления служит специфика строения точки роста растений: дистальная ее часть, представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет средний диаметр 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм. В нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы.

Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от меристематического экспланта. При этом отмечается закономерность: чем больше листовых зачатков и тканей, тем легче идут процессы морфогенеза, заканчивающиеся образованием целого растения. Вместе с тем, при таком развитии конуса нарастания увеличивается риск быстрой транспортировки вируса по проводящей системе. Кроме того, даже небольшой меристематический эксплант может содержать вирусы, проникшие в клетки в результате медленного распространения через плазмодесмы.

В целом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами растений может оказаться довольно низкой. Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термо- или химиотерапии исходных растений.

Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование горячего сухого воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной их них при высоких температурах разрушаются белковая оболочка и нуклеиновая кислота вируса. Вторая гипотеза предполагает действие высоких температур на вирусы через метаболизм растений. При такой температуре начинает преобладать деградация вирусных частиц, а синтез их, наоборот, уменьшается. Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в термокамеры, где температура в течение первой недели повышается с 25 до 37оС путем ежедневного увеличения температуры на 2 градуса. Все остальные режимы обязательно поддерживаются в оптимальном состоянии: освещенность, высокая относительная влажность воздуха, определенный фотопериод. Продолжительность термостатирования зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если для гвоздики достаточно 10 — 12 недельного воздействия теплом, то для хризантемы этот период превышает 12 недель.

Помимо положительного действия высоких температур на освобождение от вирусов, выявлено аналогичное влияние их на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, фрезии) в условиях in vitro. Высокие температуры увеличивают коэффициент размножения на 50 — 60%, повышаю адаптацию пробирочных растений к почвенным условиям и позволяют получить больше безвирусных маточных растений.

Другой способ оздоровления — химиотерапия. В питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, добавляют препарат вирозола в концентрации 20 — 50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Применение его позволяет увеличить число безвирусных растений с 40% до 80 — 100%.

Современное питомниководство и садоводство в нашей стране должно идти по пути национализации отрасли. Для этого необходимо развивать достойную альтернативу европейской системе выращивания и сертификации посадочного материала высших категорий качества. В настоящий момент в России существует дефицит сертифицированных безвирусных оздоровленных саженцев плодовых, ягодных и особенно орехоплодных культур.

Другая проблема — сортимент отечественных саженцев, который часто не выдерживает конкуренции с европейским. Селекция за рубежом направлена на получение сортов транспортабельных, лежких в торговых залах, и длительно-хранимых плодов и ягод определенного цвета и калибра, но уступает российской по устойчивости к болезням, зимостойкости и вкусовым качествам продукции. Поэтому достаточно часто южные регионы нашей страны, которые по климатическим параметрам могут выращивать импортные сорта плодовых и ягодных культур, завозят из европейских питомников посадочный материал, пораженный болезнями.

Изменить подход

Для того, чтобы обеспечить отечественных производителей конкурентноспособным качественным посадочным материалом высокого качества, требуется принципиально поменять подход в производстве и сертификации саженцев.

Прежде всего селекционным учреждениям нужно определить сортимент из своих генетических баз, оптимально соответствующий требованиям рынка по качеству продукции, и популяризировать выделенный сортимент плодовых и ягодных культур.

Наряду с этим, большое внимание надо уделять созданию базы исходных растений плодовых и ягодных культур, которые станут основой создания базового посадочного материала для сертифицированных питомников, обеспечивающих уже непосредственных производителей плодово-ягодной продукции. Естественно, на каждом этапе необходим контроль качества, в котором должен быть заинтересован производитель посадочного материала.

Метод клонального микроразмножения

Для осуществления четкой работы этой системы требуется не только нормативная база, но и четкое соблюдение методологии производства. Достаточно активно в этой системе должны применяться методы оздоровления культур, размножения и сохранения оздоровленных исходных форм. В этой системе важная роль отводится методу клонального микроразмножения, который позволяет не только проводить мероприятия по оздоровлению, например методом хемотерапии, но и массовому тиражированию оздоровленных безвирусных форм. Контроль в этой области осуществляется согласно ГОСТ Р 54051-2010. Также необходимо уделять особое внимание генетической стабильности культивируемых микрорастений.

Клональное микроразмножение относится к вегетативному размножению растений, но осуществляемому в стерильных условиях. Метод позволяет за короткий промежуток времени из меристематических тканей (точка роста побега, вычленяемая из вегетативной почки под микроскопом в стерильных условиях) получить большое количество растений — от нескольких тысяч до десятков и сотен тысяч единиц. Коротким промежутком времени принято считать от 7-8 до 12-18 месяцев в зависимости от необходимых объемов.

Этапы клонального микроразмножения

Работа этим методом осуществляется круглый год и состоит из следующих этапов: отбор претендента на введение в культуру, его диагностика на вирусную инфекцию и оздоровление при необходимости. Следующий этап – введение в культуру in vitro на искусственную питательную среду, которая состоит из макро- и микроэлементов, витаминов, углеводов. Введение в культуру завершается после начала развития меристематической верхушки, взятой из вегетативной почки. Далее начинается этап размножения или пролиферации — последовательные пересадки на свежие питательные среды с разделением образовавшихся конгломератов микропобегов. Этап тиражирования заключается в обеспечении условий, способствующих закладке боковых побегов в базальной части исходного микрорастения – введение в питательную среду цитокининов.

После получения необходимого количества микрорастений определенной культуры начинается этап укоренения, на котором микрорастения образуют корешки под влиянием регуляторов роста ауксиновой природы.

Завершается этот этап отбором растений для высадки в стерильный грунт (в кассеты) при высокой влажности для прохождения адаптации.

После адаптации растения пересаживаются в тару большего объема для доращивания, длящегося несколько месяцев.

Предпочтительнее, чтобы после доращивания до высадки в питомник растения прошли период покоя.

Для роста и развития растений в защищенном грунте при адаптации и доращивании желательно применять биоудобрения, удобрения с микроэлементами, аминокислотами. Следует в эти периоды уделять внимание и защите растений от болезней и вредителей, характерных для защищенного грунта. Опять же лучше идти по пути биологизации защиты и питания растений.

Вирусный контроль

При работе с растениями как в лаборатории, так и в защищенном грунте обязателен контроль растений на вирусы, с оформлением протоколов испытаний. Микрорастения контролируют методом ПЦР, растения в теплице достаточно контролировать методом ИФА, но некоторые вирусы и фитоплазмы контролируются также при помощи ПЦР (Методические указания: Технология получения оздоровленного от вирусов посадочного материала плодовых и ягодных культур, разработанных ВСТИСП).

Такая технология получения безвирусного оздоровленного посадочного материала для закладки питомников возможна только на правильно организованной базе, с наличием обученного квалифицированного персонала, имеющего профильное образование. Работы по клональному микроразмножению должны вестись только в специально оборудованной лаборатории, что позволит выпускать качественные растения с наименьшими потерями. Грамотно организованная лаборатория позволит соблюсти логистику производства и обеспечить оптимальные условия для культивирования микрорастений.

Автор: руководитель направления клонального микроразмножения и оздоровления растений, кандидат сельскохозяйственных наук Фролова Людмила Владимировна

Читайте также: