Бродильный метод посева воды

Добавил пользователь Владимир З.
Обновлено: 19.09.2024

Regulatory documents and methods for microbiological testing of drinking water

The use of reliable methods for control of water quality regarding bacterial contamination is one of important tasks of the preventive sanitaryepidemiologic surveillance system. This article looks at regulatory documents on the safety of drinking water. One of the regulatory parameters for the safety of drinking water is the microbiological parameter. Comparison of microbiological indicators for the safety of drinking water was made between the Law of the Kyrgyz Republic the Technical Regulation "On safety of drinking water" and the EU Directive (98/83/EU) "On quality of water intended for human consumption". For microbiological studies such methods are used as membrane filter method, fermentative method, titration method, direct inoculation method.

Регламентирующие документы и методы, используемые для оценки микробиологических показателей качества питьевой воды

Научно-производственное объединение "Профилактическая медицина", г.Бишкек

Вода - важнейшая составляющая среды обитания человека. Обеспечение населения безопасной питьевой водой, качество которой должно соответствовать установленным гигиеническим требованиям в эпидемическом отношении является первоочередной задачей для санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Целью настоящей работы является анализ регламентирующих документов по безопасности питьевой воды и изучение методов оценки по микробиологическим индикаторам.

Как известно, Кыргызская Республика является членом Всемирной торговой организации с 1998 года, что обусловило необходимость гармонизации нормативных правовых актов с международными стандартами. В связи, с чем был начат процесс пересмотра существующей законодательной базы и регламентирующих документов, в частности, по питьевой воде. Жогорку Кенешем КР 21.04.2011 г. был принят Закон Кыргызской Республики "Об основах технического регулирования в КР". Этот Закон является Техническим регламентом и устанавливает обязательные для применения и исполнения требования к объектам технического регулирования. Объектом Технического регламента является: питьевая вода, находящаяся в системах питьевого водоснабжения; предназначенная для употребления людьми и использования в производстве пищевых продуктов.

В настоящем Техническом регламенте представлены нормативные показатели безопасности питьевой воды как для централизованных систем (приложение 1), так и не централизованного водоснабжения (приложение 2) [2].

Закон КР Технический Регламент "О безопасности питьевой воды", в соответствии со статьей 20, вступает в силу по истечении одного года со дня официального опубликования, т.е. с 21 апреля 2012 года. До вступления в силу настоящего Закона действовали требования, установленные ранее, в соответствии с нормативными правовыми актами Кыргызской Республики:

- СанПиН 2.1.4.002-03 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества";

- СанПиН 2.1.4.544-96 "Требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников";

- ГОСТ 18963-73 "Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа";

- МУ 2.1.4.1184-03 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной емкости. Контроль качества";

- КМС ISO 19458:2009 "Качество воды. Отбор проб для микробиологического анализа".

Нами был проведен сравнительный анализ микробиологических показателей качества питьевой воды согласно СанПиН 2.1.4.002-03, СанПиН 2.1.4.544-96 и Техническому регламенту [7, 8, 2]. Данные основных показателей безопасности питьевой воды из централизованных систем и нецентрализованного водоснабжения приведены в таблицах 1 и 2.

В техническом регламенте для микробиологической оценки качества питьевой воды из централизованных систем, отменены оп-

Таблица 1. Сравнительная характеристика микробиологических показателей качества

питьевой воды из централизованных систем

Единицы измерения Нормативы ПДК Единицы измерения Нормативы ПДК

Термотолерантные колиформные бактерии отменен отменен Число бактерий в 100 мл отсутствие

Общие колиформные бактерии отменен отменен Число бактерий в 100 мл отсутствие

Общее микробное число отменен отменен Число образующих колонии бактерий в 1 мл не более 50

Колифаги Число бляшко-образующих единиц (БОЕ) в 100 мл отсутствие Число бляшко-образующих единиц (БОЕ) в 100 мл отсутствие

Эшерихия коли (Esherichia coli) Число бактерий в 100 мл отсутствие X X

Энтерококки (Enterococci) Число бактерий в 100 мл отсутствие X X

ределение показателей общего микробного числа и общих колиформных бактерий и введены новые показатели Escherichia coli, Enterococci, которые ранее не регламентировались в СанПиН 2.1.4.002-03.

Данный технический регламент гармонизирован с Директивой Совета Европейского Союза (98/83/ЕС) "О качестве воды, предназначенной для употребления людьми".

В европейском регионе имеется Евро-

пейский комитет по Стандартизации, где утверждаются стандарты в соответствии с их уставом. Далее этот стандарт обязуются применять следующие страны: Бельгия, Дания, Германия, Финляндия, Франция, Греция, Ирландия, Исландия, Италия, Люксембург, Нидерланды, Норвегия, Австрия, Португалия, Швеция, Швейцария, Испания, Чешская Республика и Объединенное Королевство.

Качество питьевой воды должно соответствовать гигиеническим нормативам. При лабораторно-производственном контроле качества воды перед её поступлением в водопроводную сеть проводится анализ на микробиологические, химические и органолепти-ческие показатели [9].

К показателям безопасности питьевой воды относятся: микробиологические, пара-зитологические, органолептические, радиологические, обобщенные показатели, неорганические и органические вещества.

Питьевая вода должна быть безопасна в эпидемическом и радиационном отношении, безвредна по химическому составу, и иметь благоприятные органолептические свойства [7].

Безопасность питьевой воды в эпидемическом отношении определяется ее соответствием нормативам по микробиологическим

Таблица 2. Сравнительная характеристика микробиологических показателей качества питьевой воды из нецентрализованного водоснабжения

Единицы измерения Нормативы ПДК Единицы измерения Нормативы ПДК

Термотолерантные колиформные бактерии Число бактерий в 100 мл отсутствие Число бактерий в 100 мл отсутствие

Общие колиформные бактерии Число бактерий в 100 мл отсутствие Число бактерий в 100 мл отсутствие

Общее микробное число Число образующих колонии микробов в 1 мл 100 Число образующих колонии микробов в 1 мл 100

При определении проводится трехкратное исследование по 100 мл отобранной пробы воды.

Превышение норматива не допускается в 95% проб, отбираемых в точках водозабора наружной и внутренней

водопроводной сети в течении 12 месяцев, при количестве исследуемых проб не менее 100 за год.

Определение проводится только в системах водоснабжения из поверхностных источников перед подачей воды в

и паразитологическим показателям [3, 7].

При исследовании микробиологических показателей качества питьевой воды из централизованных систем каждая проба, исследуется на наличие термотолерантных колиформ-ных бактерий, общих колиформных бактерий, общего микробного числа и колифагов [9].

Контроль за качеством подаваемой воды осуществляется общепринятыми микробиологическими методами [4], опирающимися на количественные параметры.

Микробиологические исследования - наиболее чувствительные, хотя и не самые быстрые способы обнаружения загрязнения систем питьевого водоснабжения. Этот процесс направлен на поиск очень малых количеств жизнеспособных организмов. Так как питательная среда и условия инкубации, а также характер и давность взятия пробы воды способны оказать влияние на выделяемые виды и их подсчет, микробиологические исследования могут иметь разную степень точности. Это означает, что стандартизация ме-

тодов и техника лабораторных анализов очень важна, если ставится задача иметь единые критерии микробиологического качества воды для различных лабораторий и в международном масштабе.

Частные анализы на наличие организмов-индикаторов фекального загрязнения остаются наиболее надежным и конкретным способом оценки гигиенического качества воды [6].

Для микробиологического исследования воды существует: ряд методов, в частности метод мембранных фильтров, бродильный метод, титрационный метод, метод прямого посева.

Метод мембранных фильтров основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификацией колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Сущность бродильного метода заключа-

ется в посеве определенных объемов анализируемой воды и подращивании при температуре 37±0,5°С в средах накопления с последующим высевом бактерий на плотную среду Эндо, дифференцировании выросших бактерий и определении наиболее вероятного числа бактерий группы кишечных палочек в 1 литре воды по таблицам.

Титрационный метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификацией колоний по культу-ральным и биохимическим тестам. Титрацион-ным методом определяют количество общих и термотолерантных колиформных бактерий.

Титрационный метод может быть использован: при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации; при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ; в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Метод прямого посева основан на выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний. Этим методом определяют споры сульфитредуцирую-щих клостридий.

Для определения колифагов можно использовать титрационный метод и прямой метод.

Определение колифагов титрационным методом в питьевой воде заключается в предварительном накоплении колифагов в среде обогащения на культуре Е. coli и последующем выявлении зон лизиса (просветления) газона Е. coli на питательном агаре. Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.

Определение колифагов прямым методом в питьевой воде заключается в исследовании нормируемого объема воды (100 мл) путем его прямого посева и последующего учета зон лизиса (бляшек) на газоне Е. coli в чашках Петри с питательным агаром.

Прямой метод выделения колифагов из

воды проводят параллельно с титрационным при исследованиях по эпидемическим показаниям.

Нами была изучена методика оценки качества питьевой воды по микробиологическим показателям, применяемая в бактериологической лаборатории ЦГСЭН г.Бишкек Кыргызской Республики.

Выявлено, что определение титра кишечной палочки в лаборатории, проводится согласно ГОСТ 18963-73 "Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа". Однако исследование проб воды проводится только бродильным методом, несмотря на то, что согласно вышеуказанному стандарту выбор метода зависит от качества исследуемой воды.

При исследовании чистой, хорошо фильтрующейся воды удобнее пользоваться методом мембранных фильтров, а бродильный метод применяется при исследовании воды, содержащей коллоидные вещества и посторонние примеси, затрудняющие процесс фильтрования. Кроме того, бродильный метод включает определение наиболее вероятного числа микроорганизмов по таблицам и является менее точным, и трудоемким. Необходимо учесть, что питьевая вода в г.Бишкек является достаточно чистой, не содержит большого количества взвешенных веществ и не отличается преобладанием в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

На наш взгляд бродильный метод применяется в данном случае из-за отсутствия необходимых материалов и оборудования, для выполнения анализа методом мембранной фильтрации, которым широко пользуются в странах Европы.

По данным А.Г.Бойцова и О.Н.Ластовкой (2005г) уже в течении 20 лет западные производители выпускают среды для определения термотолерантных колиформ, предлагают для анализа проб питьевой воды автоматизированные системы бактериологического контроля в потоке, направленные прежде всего на определение E.coli. Также следует отметить, что в России для определение бактерии групп кишечной палочки по глюкозе,

методические разработки рекомендуют использование среды Эндо, основанной на лактозе. К сожалению, отставание в методическом плане, сегодня не позволяет производителям воды использовать современные зарубежные наработки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Проблема использования надежных методов контроля качества воды в отношении бактериального загрязнения является одной из актуальных в системе предупредительного санитарно-эпидемиологического надзора.

В основе эффективности контроля качества воды лежат обоснованность нормативной базы, наличие методов контроля, их качество и соответствующее материально-техническое обеспечение, а также регламентации взаимодействия эксплуатационных служб и контролирующих организаций с разграничением сфер влияния и ответственности [1].

Выбор метода, прежде всего зависит от качества исследуемой воды. При исследовании чистой, хорошо фильтрующейся воды удобнее пользоваться методом мембранных фильтров. При исследовании воды, содержащей коллоидные вещества и посторонние примеси, затрудняющие процесс фильтрования, используют бродильный метод.

Качество фильтрующих мембран может оказывать существенное влияние на результаты санитарно-микробиологических исследований воды при работе мембранным методом. Процедура контроля качества мембранных фильтров, обязательная для аккредитованных в области исследования воды лабораторий, регламентирована МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды" [5].

1. Бойцов А.Г., Ластовка О.Н., Кашкарова Г.П., Благова О.Е. Оценка качества воды по биологическим показателям: пути совершенствования // Гигиена и санитария, 2005, №1, c.74-75.

2. Закон Кыргызской Республики. Технический регламент "О безопасности питьевой воды" принят Жогорку Кенешем КР 21.04.2011г.

3. Лакшин А.М., Катаева В.А. Общая гигиена с основами экологии человека, М.: Медицина, 2004, c.83-84.

5. Организация внутреннего контроля качества санитарно-мик-робиологических исследований воды: МУ 2.1.4.1057-01 -М.,2001.

6. Руководство по контролю качества питьевой воды // Всемирная организация здравоохранения, 1994, т.1, 257 с.

7. СанПиН 2.1.4.002-03 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества" утвержден Постановлением Главного государственного санитарного врача Кыргызской Республики №9 от 20.02.2004 г. - С.1-5.

8. СанПиН 2.1.4.544-96 "Требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников" утвержден Постановлением Главного государственного санитарного врача Кыргызской Республики №15 от 30.03.1998 г.

9. Чукулов Ж.Т., Баум Л.И. Питьевая вода Кыргызстана. Сборник статей и материалов. - Бишкек: Учкун, 2007, с.172-175.

12. NF EN 26461-2 ISO 6461-2 Norme europeenne (norme francaise) "Качество воды - Определение и подсчет спор сульфитредуциру-ющих анаэробов (клостридии)", Juillet 1993, 7 p.

13. NF EN 7899-2 European standard (French standard) "Качество воды - подсчет и определение кишечных энтерококков", August 2000, 15 p.

Regulatory documents and methods for microbiological testing of drinking water quality

Scientific and Production Centre for Preventive Medicine, Bishkek

The use of reliable methods for control of water quality regarding bacterial contamination is one of important tasks of the preventive sani-tary-epidemiologic surveillance system.

This article looks at regulatory documents on the safety of drinking water. One of the regulatory parameters for the safety of drinking water is the microbiological parameter.

Comparison of microbiological indicators for the safety of drinking water was made between the Law of the Kyrgyz Republic - the Technical Regulation "On safety of drinking water" and the EU Directive (98/83/EU) "On quality of water intended for human consumption".

For microbiological studies such methods are used as membrane filter method, fermentative method, titration method, direct inoculation method.

Цель работы: изучение методов оценки санитарнобактериологического состояния питьевой воды и воды из естественных водоемов.

Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям, предъявляемым к питьевой воде действующими нормативными документами. Безопасность воды в эпидемиологическом отношении определяют по общему числу микроорганизмов и количеству бактерий группы кишечных палочек в ее определенном объеме.

Качество воды централизованных систем питьевого водоснабжения определяют в соответствии с санитарными правилами и нормами. Питьевая вода должна быть безопасна в эпидемиологическом и радиационном отношениях, безопасна по химическому составу и иметь благоприятные органолептические свойства (табл. 12.1).

Таблица 12.1. Безопасность питьевой воды в эпидемиологическом отношении (по микробиологическим и паразитологическим показателям) СанПиН 2.1.4.1074-01

Общее микробное число (ОМЧ)

Число КОЕ в 1 см 3

Термотолерантные колиформные бактерии

Число бактерий в 100 см 3

Общие колиформные бактерии

Число бактерий в 100 см3

Число БОЕ* в 100 см 3

Споры сульфитредуцирующих бактерий

Число спор в 20 см 3

Число цист в 50 дм 3

* БОЕ - бляшкообразующие единицы.

12.1. Отбор проб и подготовка их к анализу

Воду для санитарно-бактериологического контроля отбирают в количестве 500 см 3 в бутылки, предварительно простерилизованные в бумажных пакетах, с ватно-марлевой пробкой, покрытой сверху бумажным колпачком.

Перед отбором пробы кран или край трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 мин воду спускают, затем производят отбор пробы. Вода подлежит анализу не позже чем через 2 ч после отбора.

Пробы воды из открытых водоемов - колодцев, бассейнов, рек, озер - отбирают с помощью батометров, представляющих собой металлический каркас с массивным свинцовым дном - грузилом. В металлический каркас вставлена бутылка. Батометр погружают на заданную глубину и открывают бутылку, потягивая за веревку, привязанную к пробке. После наполнения бутылки батометр извлекают и закрывают ее стерильной пробкой.

Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором, так как под действием хлора микробы в воде погибают. В качестве дехлоратора используют серноватистый натрий из расчета 10 мг на 500 см исследуемой воды.

К отобранным пробам воды прилагают сопроводительный документ с указанием соответствующих данных. Доставку проб питьевой воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре от 4 до 10 °С.

12.2. Определение общего микробного числа воды

Общее микробное число (ОМЧ) - это количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, образующих колонии на мясопептонном агаре при посеве 1 см 3 воды с последующей инкубацией посевов при температуре 37±0,5 °С в течение 48 ч. ОМЧ должно быть не более 50 КОЕ/см 3 .

В зависимости от степени предполагаемого загрязнения производят посев не менее двух различных объемов воды, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках вырастало от 30 до 300 колоний. Водопроводную и артезианскую воду засевают в неразведенном виде по 1 см 3 . При бактериологическом исследовании загрязненных вод делают посевы разведенной воды. Разведения готовят так, как указано в разделе 8.3.

Из исследуемого образца и из пробирок с его разведениями в соответствии со степенью предполагаемого микробного загрязнения отбирают по 1 см 3 , вносят в стерильные чашки Петри и заливают 10-12 см расплавленного и остуженного до температуры 45 °С мясопептонного агара. Круговыми движениями руки, вращая чашки по горизонтальной поверхности стола, распределяют их содержимое равномерным слоем по всей площади дна. После застывания агара чашки с посевами помещают на 24 ч в термостат при температуре 37 °С. После инкубации подсчитывают число выросших колоний.

Определение микробного числа указанным методом позволяет выявить лишь мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы.

12.3. Определение содержания колиформных бактерий в воде

С эпидемиологической точки зрения особенно важным является обнаружение в воде патогенных микроорганизмов - возбудителей кишечных инфекций (брюшного тифа, дизентерии, холеры и др.) Однако в связи с большой трудностью обнаружения патогенных микроорганизмов при бактериологических анализах ограничиваются определением так называемых санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ). К санитарно-показательным относят микроорганизмы, постоянно находящиеся в естественных полостях человека или животных. Присутствие СПМ в различных объектах внешней среды является индикатором их загрязнения человеком. Чем больше СПМ во внешней среде, тем более вероятным становится присутствие специфических возбудителей инфекционных заболеваний.

В качестве СПМ наибольшее значение имеют бактерии группы кишечных палочек (БГКП). К группе кишечных палочек относят колиформные бактерии родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia.

При определении количества СПМ в воде используют следующие характеристики:

• коли-титр - наименьший объем воды, в котором обнаружена одна кишечная палочка. Для питьевой воды, прошедшей очистку, титр кишечной палочки должен быть не менее 300 см 3 ;

• коли-индекс - количество кишечных палочек в 1 дм 3 воды. Коли-индекс для питьевой воды должен быть не более 3.

Колиформные бактерии определяют в воде методом мембранных фильтров или бродильным методом.

Бродильный метод. Сущность бродильного метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды, инкубации

посевов при температуре 37 °С в средах накопления с последующим высевом на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и определением наиболее вероятного числа БГКП в 1 дм 3 воды.

При исследовании воды централизованного водоснабжения исследуемый материал дважды засевают в три объема: 100, 10 и 1 см 3 . Для исследования речной, озерной, прудовой воды готовят десятикратные разведения 1:10, 1:100, 1:1000 и засевают еще 10 см 3 и 1 см 3 без разведения. Посев воды производят в бродильные сосуды (колбы, бутылки, пробирки с поплавками), заполненные глюкозопептонной средой Эйкмана. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 24 ч.

Обработка результатов анализа. По окончании инкубации посевы просматривают и делают следующие выводы:

а) при отсутствии газообразования и изменения цвета среды дают отрицательный ответ на наличие БГКП в исследуемом объеме воды, дающим право закончить исследование через 24 ч;

б) при образовании кислоты и газа производится высев материала из бродильных сосудов на среду Эндо. Высев делается бактериологической петлей густым штрихом для получения изолированных колоний. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч. После инкубации посевы просматривают. Отсутствие на среде Эндо характерных для кишечных палочек колоний дает основание на выдачу отрицательного ответа и окончание исследования;

в) при обнаружении на среде Эндо лактозоположительных темно-красных колоний, с металлическим блеском или без него, необходимо установить принадлежность выросших микроорганизмов к семейству кишечных бактерий. С этой целью производится микроскопирование препарата из колоний и постановка оксидазного теста.

Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonodaceae и других водных сапрофитов, которые, в отличие от кишечных бактерий, вырабатывают фермент оксидазу.

Для постановки оксидазного теста со среды Эндо снимают петлей по 2-3 колонии каждого типа. Микробную массу наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную специальным реактивом (30 г α-д-нафтола растворяют в 2,5 см 3 этанола, прибавляют 7,5 см 3 дистиллированной воды и 40 мг диметил-парафенилендиамина. Раствор готовят непосредственно перед определением).

При отрицательном результате оксидазного теста бумага при контакте с колонией цвета не меняет. Если же бумага синеет в течение 1 мин при контакте с колонией, то оксидазный тест считают положительным.

Наличие в препарате грамотрицательных неспорообразующих палочек, не обладающих оксидазной активностью, позволяет немедленно дать ответ о наличии в воде БГКП.

При обнаружении на среде Эндо розовых и бесцветных колоний ведут подсчет и пересевают 2-3 изолированные колонии каждого типа в глюкозо-пептонную среду Эйкмана. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 3-4 ч. При образовании кислоты (изменение цвета среды) и газа, накапливающегося в поплавке, результат считается положительным, при отсутствии кислото- и газообразования - отрицательным.

После проведения анализа записывают в лабораторный журнал окончательные результаты (положительные и отрицательные) по каждому засеянному объему и определяют коли-титр и коли-индекс.

Метод мембранных фильтров. Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема воды на мембранных фильтрах с последующим выращиванием их на среде Эндо при температуре 37 °С, дифференцированием выросших колоний и подсчетом количества БГКП в 1 см 3 воды.

Подготовка мембранных фильтров. Для фильтрования воды отбирают мембранные фильтры № 3, помещают их в подогретую до температуры 80 °С дистиллированную воду и ставят на небольшой огонь для кипячения. Кипячение проводят трижды по 10 мин. После первого и второго кипячения воду сливают, а после третьего фильтры оставляют в воде до употребления.

Подготовка фильтровального аппарата. Фильтровальный аппарат стерилизуют в автоклаве или протирают ватным тампоном, смоченным в спирте, и обжигают в целях стерилизации. На столик фильтровального аппарата стерильным пинцетом помещают мембранный фильтр. Во избежание повреждения фильтра под него подкладывают кружок стерильной фильтровальной бумаги. На фильтровальный столик с положенными на него фильтрами устанавливают и закрепляют верхнюю часть прибора - воронку (рис. 12.1).

Рис. 12.1. Определение количества микроорганизмов методом мембранных фильтров

Обработка результатов анализа. По окончании инкубации посевы просматривают и делают следующие выводы:

а) отсутствие микробного роста на фильтрах или обнаружение на них колоний, не характерных для БГКП, позволяет закончить исследования на этом этапе анализа с выдачей отрицательного результата на присутствие БГКП в анализируемом объеме воды;

б) при обнаружении на фильтре колоний, характерных для БГКП, исследование продолжают. Из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Отсутствие в мазках мелких грамотрицательных неспороносных палочек является основанием для прекращения анализа с выдачей отрицательного результата на присутствие БГКП в исследуемом объеме воды;

в) при наличии в мазках грамотрицательных палочек, морфологически сходных с кишечными, ставится оксидазная проба. При обнаружении на мембранных фильтрах однотипных лактозоположительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него), не вырабатывающих оксидазы, анализ воды на этом этапе заканчивают и подсчитывают число выросших на мембранном фильтре колоний кишечных палочек. Результат выражают в виде коли- индекса в пересчете на 1 дм 3 воды;

г) при обнаружении на мембранных фильтрах розовых и бесцветных колоний подсчитывают их число и пересевают 2-3 изолированные колонии каждого типа в глюкозо-пептонную среду Эйкмана. После инкубации в течение 3-4 ч при температуре 37 °С отмечают изменение цвета среды за счет образования кислоты и накопления газа в поплавке. В этом случае результат считается положительным. Если изменений в среде нет, то дают отрицательный результат на присутствие БГКП.

Пример определения колииндекса: профильтровано три объема воды по 100 см 3 . На первом и втором фильтрах выросло по три колонии, на третьем - девять колоний. Всего выросло пятнадцать колоний. Таким образом, колииндекс исследуемого образца воды равен: (1000 х 15):300 = 50. Колииндекс переводится в колититр следующим образом: 1000:50 = 20.

Контрольные вопросы

1. Какие Вы знаете показатели эпидемиологической безопасности питьевой воды?

2. Что такое общее микробное число, колититр и колииндекс?

3. Какие роды микроорганизмов входят в БГКП?

4. Какими методами определяют колиформные бактерии?

5. Каковы основные критерии, по которым устанавливают присутствие колиформных бактерий в питьевой воде?

1. Презентация на тему: Санитарная микробиология

2. Санитарно-микробиологическое исследование воды

Отбор проб воды:
Пробы воды отбирают в стерильные
бутылки или специальными приборами
батометрами
Пробу берут в количестве 400-500 мл
Доставить воду необходимо в течении 2
часов.
Исследование включает определение :
общее количество бактерий в 1 мл воды;
количество микроорганизмов , колииндекс, коли-титр;
определяют наличие патогенных микробов
в воде.
Батометр

3. Техника сбора, хранения и транспортировки проб воды

При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из
крана производят после предварительной его стерилизации
обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 минут при
полностью открытом кране. После наполнения емкость закрывают
стерильной пробкой и колпачком. Отобранную пробу маркируют и
сопровождают актом отбора проб воды с указанием названием пробы,
места забора, даты (год, месяц, число, час), цель исследования, куда
направляется проба для исследования, подпись лица, взявшего пробу.
Доставка проб осуществляется в контейнерах-холодильниках при
температуре 4-10°С. В холодный период года контейнеры должны быть
снабжены термоизолирующими материалами, обеспечивающими
предохранение проб от промерзания. При соблюдении указанных
условий срок начала исследований от момента отбора проб не должен
превышать 6 часов. Если пробы нельзя охладить, их анализ следует
провести в течение 2 часов после забора.

4. Бродильный метод

заключается в посеве определенных объемов воды и выращивании при 43
0 5 С в жидкой питательной среде накопления ( с поплавками) с последующим высевом
бактерий на плотную агаровую среду Эндо, дифференцировании вероятного числа кишечных
палочек в 1 л воды.
Для исследования минеральной воды бродильным методом используют 2 объема по 100 мл и
10 объемов по 10 мл. Указанные объемы воды засевают в концентрированную
глюкозопептонную среду Эйкмана, Посевы выращивают при 43 С в течение 18 - 24 часов.
Затем производят пересев на чашку со средой Эндо и выросшие колонии при 37 С после
микроскопии идентифицируют по вторичной бродильной пробе.

5. Метод мембранных фильтров

Метод определения количества клеток E.coli в единице объема жидкости
(коли-индекс); суть метода заключается в фильтровании анализируемой
жидкости через мембранные фильтры, задерживающие бактерии, после
чего фильтры помещают на среду Эндо, ставят в термостат вверх дном и
инкубируют посевы при температуре (37 + 1)°С в течение 24 + 2 часов.

6. Санитарно-микробиологическое исследование почвы

7. Определяемые показатели при исследование почвы

К методам определения микробиологических показателей, характеризующих фекальное загрязнение почвы, относятся
следующие:
1. Определение количества бактерий группы кишечных палочек, энтерококков, энтеровирусов.
2. Определение кишечных палочек в почве титрационным методом.
3. Определение кишечных палочек в почве методом мембранных фильтров.
4. Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды для учета кишечных палочек в почве.
5. Определение в почве общего количества бактерий,
6. Определение Clostridium perfringens в почве.
К методам определения микроорганизмов, характеризующих загрязнение и самоочищение почвы от органических и
химических загрязнений, относятся:
1. Определение общей численности почвенных сапрофитных микроорганизмов.
2. Определение общей численности почвенных микроорганизмов методом прямой микроскопии.
3. Определение общего числа и процента почвенных бацилл.
4. Определение количества грибов и актиномицетов в почве.
5. Определение аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов.
6. Определение аммонификаторов в почве.
7. Определение токсичности почв к микроорганизмам.
К методам определения патогенных бактерий и вирусов в почве относятся следующие:
1. Определение сальмонелл в почве.
2. Индикация и выделение патогенных клостридий из почвы.
3. Идентификация и выделение столбнячной палочки.
4. Индикация и выделение ботулинической палочки.
5. Обнаружение сибиреязвенной палочки в почве.

8. Определение Clostridium perfringens в почве

Из всех приготовленных
почвенных разведений (до 1 :
1000 000) по 1 мл переносится в
два параллельных ряда
пробирок. Один ряд пробирок
прогревают при температуре
80°С в течение 15 минут или
при 90°С — 10 минут. Затем во
все пробирки наливают по 9—
10 мл среды Вильсон— Блер.
Инкубация посевов
производится при 37° С в
течение 24 часов.
Cl. perfringens образуют
колонии черного цвета, в мазках
— грамположительные палочки.

9. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха

Исследования проводят как в плановом порядке, так и по эпидемиологическим
показаниям. Бактериологическое исследование воздушной среды
предусматривает:
— определение общего содержания микробов в 1 м3 воздуха;
— определение содержания золотистого стафилококка в 1 м3 воздуха.
Отбор проб воздуха для бактериального исследования проводят в следующих
помещениях:
* операционных блоках;
* перевязочных;
* послеоперационных палатах;
* родильных залах;
* палатах для новорожденных;
* палатах для недоношенных детей;
* послеродовых палатах;
* отделениях и палатах интенсивной терапии и других помещениях, требующих
асептических условий.

10. Методы забора проб

Существуют два основных способа отбора проб
воздуха для исследования:
1. седиментационный — основан на
механическом оседании микроорганизмов;
2. аспирационный — основан на
активном просасывании воздуха
(этот метод дает возможность
определить не только качественное,
но и количественное содержание
бактерий). ( ЕА 100 АЦ ) =>

11. Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов

Для микробиологических анализов пробы отбирают по ГОСТ Р 534302009.Определения качества молока и молочных продуктов важно установить не
только общее количество содержащихся в них микробов, из которых некоторые
обладают полезными качествами. но и выявить бактерии кишечной палочки
(эшерихий), являющиеся санитарно-показательными микроорганизмами.
Среда ПЖ-65 предназначается для выделении из молока, сливок, сметаны, творога,
масла и сыров бактерий кишечной палочки и сальмонелл. Среду готовят по
следующей прописи (в г): лактозы 20,0. фосфорно-кислого калия (двузамещенного) 3,0, питательного агара (в порошке) - 50,0, стерилизованной желчи крупного рогатого
скота - 100 мл, 1% -ного спиртового раствора бриллиантовой зелени-2 мл. Указанные
компоненты растворяют при подогреве и помешивании в 900 мл дистиллированной
воды, устанавливают рН 7,2-7,3, разливают столбиком в пробирки по 5 мл,
прогревают текучим паром при 100° в течение 15 минут, охлаждают до 45-46° и
вносят в пробирки со средой разведения молока или молочного продукта,
предварительно растертого в стерильной ступке с физиологическим раствором
хлорида натрия аС1, Высевы из молока и продуктов делают в разведениях 1: 5, 1: 10,
1: 100, 1: 1000 и т.д. Инкубируют в термостате при температуре 43-44е.

При наличии в продукте
эшерихий, даже в разведениях до
10"9 через 16-18 часов
инкубирования происходит
разрыв столбика среды, но
первоначальный ее зеленый цвет
не изменяется. При росте
сальмонелл среда приобретает
оливковый цвет, без разрыва ее
массы. Грамположительные
микроорганизмы на среде "ПЖ65" не развиваются.
Производственная проверка этой
среды в десяти областных
ветеринарных лабораториях
Украины показала, что она
значительно сокращает срок
анализа при обнаружении в
молоке и молочных продуктах
бактерий кишечной палочки.

14. Санитарно-микробиологическое исследование Мяса

Мясо и мясные продукты подвергают бактериологическому исследованию во всех
случаях, когда предполагается обсеменение их возбудителями инфекций,
патогенными для человека, или же микрофлорой, вызывающей порчу продуктов.
Готовая продукция также исследуется в порядке санитарно-бактериологического
контроля.
Взятие проб. Пробы берут стерильным ножом из разных частей туши. Каждую пробу
мяса или органов в количестве 200 г заворачивают в чистую пергаментную бумагу, на
которой ставят номер. Несколько проб, взятых от одной туши, упаковывают в
бумажный пакет, пломбируют и направляют в лабораторию. В сопроводительном
документе обозначают дату и место взятия проб от животного, номер туши, причину
и цель исследования. Все эти сведения заверяются подписью отправителя.
Колбасные изделия. Колбасные изделия подвергаются бактериологическому
исследованию в случаях обнаружения фактов использования в производстве
подозрительного в отношении доброкачественности мясного сырья, нарушения
санитарно-гигиенического режима производственных процессов, получения
сомнительных данных при органолептической оценке продукта. Отобранные образцы
завертывают в пергаментную или оберточную бумагу (каждый из них нумеруется в
отдельности), упаковывают в один пакет, опломбировывают и направляют в
лабораторию, приложив акт об изъятии образцов, в котором указывается место и дата
отбора и изготовления пробы, название продукта, его сорт, причина и цель исследования

Исследование мяса состоит из следующих этапов:
1. Органолептическая оценка мяса.
2.Микроскопическое исследование препаратов,
приготовленных из мяса, окрашенных по Граму, на капсулу и
споры.
3.Первичный посев на МПА, МПБ, селективные и
специальные среды, среды обогащения.
4.Идентификация выделенных культур по морфологическим,
культурально-биохимическим и антигенным свойствам.
5.Заражение лабораторных животных в необходимых
случаях.
Продолжительность бактериологического исследования мяса
3 суток, при постановке биопробы до 10 суток. Исследуемые
туши после взятия проб помещают в холодильник-изолятор
при температуре 0-40С.

1. Органолептическая оценка мяса. Доброкачественное мясо при подсыхании
образует корочку бледно-красного цвета. На разрезе оно плотное, эластичное, ямка
после надавливания быстро исчезает. Несвежее мясо покрыто плотной, темно-красной
или ослизненной корочкой. Консистенция его мягкая, несколько дряблая, образующаяся
при надавливании ямка восстанавливается. Поверхность испорченного
мяса ослизненная, консистенция дряблая, мажущаяся; жир слизистый с прогорклым
запахом – такое мясо бракуют.
2.Для микроскопического исследования мяса из каждой пробы готовят препаратыотпечатки для окрашивания по Граму, на наличие капсул - по Ольту или Михину. В
каждом препарате изучают не менее 25 полей зрения.
Для приготовления препарата-отпечатка стерильными ножницами вырезают из
середины каждого образца кусочек размером 1,5х2х2,5 см и прикладывают к
предметному стеклу местом свежего среза. Делают по 3 отпечатка на 2-3 предметных
стеклах. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем
горелки. Мазки можно фиксировать физическим или химическим методом. При
химическом методе фиксации препараты погружают в метанол на 5 мин или на 15 мин в
смесь Никифорова (равные объемы спирта и эфира), окрашивают по Граму и
подсчитывают количество микроорганизмов в каждом поле зрения, учитывая отдельно
шаровидные и палочковидные

Мясо считается свежим, если в мазках-отпечатках
не обнаружена микрофлора или в поле зрения
препарата видны единичные (до 10 клеток) кокки
и палочковидные бактерии и нет следов распада
мышечной ткани. Препарат-отпечаток из мяса
сомнительной свежести окрашивается
удовлетворительно, видны следы распада
мышечной ткани, ядра мышечных волокон в
состоянии распада. При просмотре в каждом поле
зрения обнаруживается не более 30 кокков или
палочек.
Препарат-отпечаток из мяса непригодного в пищу,
окрашивается хорошо. В поле зрения в
препаратах, как из поверхностных, так и из
глубинных слоев преобладают палочки. При
сильном разложении мяса кокки почти
отсутствуют, все поле зрения состоит из палочек.
Среди них могут быть кишечные палочки,
флуоресцирующие бактерии, спорообразующие
бактерии. (Из аэробных спорообразующих
бактерий – Bac.subtilis, Bac.mycoides; из
факультативно-анаэробных – Proteus vulgaris, из
анаэробных - Cl.putrificus, Cl.sporogenes).

18. Санитарно-микробиологическое исследование консервов

Бактериологическое исследование готовых консервов проводится по ГОСТ 30425—97. Консервы.
Метод определения промышленной стерильности, ГОСТ 10444.15—94. Продукты пищевые. Методы
определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.
Анализ готовой продукции проводится лабораториями центров Госсанэпиднадзора, как правило, с
целью установления промышленной стерильности консервов. Консервированные продукты,
удовлетворяющие требованиям промышленной стерильности, не должны представлять опасность для
здоровья потребителя и не должны портиться во время хранения. Готовые консервы не должны
содержать патогенных микробов и иметь признаков порчи, обусловленных жизнедеятельностью
микробов
.Отбор проб для исследования (ГОСТ 26668—85)
Проводят внешний осмотр банок. Отмечают наличие ржавчины, деформации, подтеков. В журнале
записывают маркировку жестяных банок, со стекляных банок отклеивают этикетку. Тщательно моют
банки теплой водой с мылом, насухо обтирают.
Проверяют герметичность банок. Для этого в эксикатор наливают свежеприготовленную в течение 15
с и охлажденную до 40—45°С воду, опускают на дно эксикатора банки и наблюдают за пузырьками
воздуха. Негерметичной считается банка, у которой из одного и того же места выходит струйка
воздуха или периодически несколько пузырьков.Негерметичные банки бактериологическому
исследованию не подлежат. Герметически упакованные, бездефектные по внешнему виду консервы
подвергаются термостатной выдержке до 10 дней при 30—55°С в зависимости от консервов для
проверки на бомбаж. О наличии бомбажа судят по вздутию дна или крышки банки. Вскрытие банки и
посев консервов производят при строгом соблюдении правил асептики (в боксах).

19. Подготовка к микробиологическому исследованию

Банки тщательно моют теплой водой и вытирают. Затем крышку банки
протирают смоченным в спирте тампоном, фламбируют и вскрывают
консервным ножом. Проводят органолептическое исследование: определяют
внешний вид, цвет, запах и состояние содержимого. Органолептические
признаки специфичны для каждого вида консервов, они должны отвечать
требованиям стандартов и технических условий.
Из каждой консервной банки отбирают одну или несколько навесок,
предназначенных для непосредственного высева и приготовления
последовательных разведений для проведения всех видов исследования. Навеску
для посева отбирают весовым или объемным методом после вскрытия банки
консервов в условиях исключающих микробное загрязнение, в образце
должны быть представлены все компоненты и в том же соотношении, что и в
продукте.
Стерильность консервов определяют в случаях, когда они выработаны по
специальным заказам и для поставок экспедициям, космонавтике и лечебным
учреждениям.

20. Выявление БГКП

Для индикации и определения БГКП предусматривают установление наличия БГКП в определенной навеске
продукта и подсчет их количества. По микробиологическим нормативам не допускается наличие БГКП в 1 г
консервированного мяса.
Методика. Для индикации БГКП проводят посев по 1 г натурального продукта и из разведений 1:10, 1:100 в
среду Кесслера. Посевы культивируют 24 ч в термостате при 370С, предварительный учет проводят через 24
ч, окончательный – через 48 ч. При отсутствии признаков роста делают заключение об отсутствии БГКП в
исследуемом продукте
При появлении роста, признаками которого являются помутнение среды, образование газа, изменение цвета
среды, проводят дальнейшие исследования. Для подтверждения принадлежности микроорганизмов к
бактериям группы кишечной палочки, из проросших пробирок делают высев 0,1 мл культуральной
жидкости на одну из дифференциально-диагностических сред – агар Эндо или агар Смирнова (характерно
появление желтых колоний). Посевы инкубируют в термостате при 370С в течение 24 ч. Из изолированных
колоний по своим культуральным признакам характерных для кишечной палочки делают препараты,
окрашивают по Граму, изучают тинкториальные и морфологические признаки.
В некоторых случаях можно проводить первичный посев 0,1 мл исходного продукта или из 10-кратного
разведения непосредственно на поверхность дифференциально-диагностических сред (Эндо), что позволит
дать заключение о наличии (или отсутствии) БГКП в определенной навеске продукта уже через 24 часа. Не
менее чем в 5-ти колониях изучают морфологию микроорганизмов в мазках, окрашенных по Граму.
Обнаружение коротких с закругленными концами грамотрицательных палочек, специфически изменяющих
цвет жидких дифференциально-диагностических сред и образующих характерные колонии на элективных
средах с лактозой, указывает на наличие БГКП. В заключении указывают, обнаружены или отсутствуют
БГКП в 1 г исследуемого продукта.

21. Выявление сальмонелл

22. Санитарно-микробиологическое исследование смывов с рук

При взятии смывов с рук протирают тампоном ладонные поверхности обеих
рук, проводя не менее 5 раз по каждой ладони и пальцам, затем протирают
межпальцевые пространства. исследование проводится для определения :
наличия БГКП; общею обсемененность с пересчетом на 1см2 исследованной
площади; в наличии Staphylococcus aureus и др патогенных микробов. Для
определения общего числа микробов в исследуемом смыве к 2 мл
изотонического раствора используемого для увлажнения тампона
прибавляют еще 8 мл и тампон тщательно отмывают встряхиванием,
полученное исходное разведение 1:10 вносят в чашке Петри и инкубируют
при 38*С 48 часов, затем подсчитывают кол-во колоний и делая пересчет на
1см2 Для определения БГКП производят посев в среду Кесслера или в 1020% желчный бульон. Через сутки инкубирования при 37 градусов делают
пересев на среду ЭНДО после инкубации в термостате при 37 градусов в
течении 24 часов подозрительные колонии микроскопируют и пересевают на
среду Гисса с глюкозой и выдерживают при 43 градусов 24 часа, после
производят учёт результатов.

18.3. Методы определения общих и термотолерантных колиформных бактерий в воде

Общие колиформные бактерии (ОКБ) – это грамотрицательные, оксидазоотрицательные палочки, не образующие спор, растущие на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37±1 °С в течение 24–48 ч. Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число ОКБ, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч.

ОКБ и ТКБ в воде, согласно действующим МУ 2.1.4.1018–01, определяют мембранным и титрационным (бродильным) методами. Титрационный метод используют только при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации, наличии в воде большого количества взвешенных веществ и в случае преобладания посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний.

18.3.1. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации

Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема воды на мембранных фильтрах с подращиванием их на среде Эндо при 37±1,0 °С, дифференцировании по культуральным и биохимическим тестам и подсчете выросших колоний.

Первый день. 1. Подготовка мембранных фильтров. Мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм (ацетатцеллюлозные, нитратцеллюлозные, ядерные и др.), имеющие сертификат качества, выпускаются стерильными, в противном случае их стерилизуют методом кипячения по инструкции, предложенной изготовителем.

Подготовка фильтровального аппарата. Фильтровальный аппарат, воронку и столик фильтровального аппарата обтирают и фламбируют марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой. Если вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток, ее сначала фильтруют через фильтр с большим диаметром пор, помещая его поверх основного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.
Фильтрование воды. В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают вакуум. При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают. Вначале фильтруют пробы обеззараженной воды или предположительно незагрязненные, а затем фильтруют загрязненные пробы. При фильтровании 1 мл исследуемой воды в воронку наливают предварительно не менее 10 мл стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду.

После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду Эндо (рецепты 96, 97), разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку помещают 3–4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37±1 °С в течение 24±2 ч.

При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл. При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.

Объем воды водоемов для посева выбирают в зависимости от степени ее предполагаемого загрязнения. Рассчитывают, чтобы не менее чем на двух фильтрах выросли изолированные колонии. Из них не более 30 колоний на фильтрах диаметром 35 мм или не более 50 колоний на фильтрах диаметром 47 мм должны быть образованы колиформными бактериями. При этом можно ориентироваться на результаты предыдущих исследований.

При исследовании воды неизвестной степени бактериального загрязнения следует засевать не менее четырех-десяти-кратных ее объемов.

Так, например, для воды водоемов, загрязняемых сточными водами, рекомендуется брать объемы 10; 1; 0,1; 0,01 мл. При анализе воды водоемов в зоне влияния выпуска сточных вод – 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл; для чистых водоемов – 100; 50; 10; 1 мл. При анализе воды незагрязненных шахтных колодцев фильтруют 100; 10; 1 и 0,1 мл.

Второй день. По окончании инкубации производят просмотр посевов:

• отсутствие микробного роста или обнаружение колоний, не характерных для ОКБ (пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые), позволяет на этом этапе анализа закончить исследования с выдачей отрицательного результата (отсутствие ОКБ и ТКБ в исследуемом объеме воды). Анализ заканчивают через 24 ч;
• при обнаружении на фильтрах типичных лактозоположительных колоний (темно-красных, красных с металлическим блеском или без него либо других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра) исследования продолжают. Подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на наличие оксидазной активности (см. гл. 9, рецепт 75). Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитов, которые в отличие от кишечных бактерий вырабатывают фермент оксидазу.

Готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют или определяют принадлежность к грамотрицательным бактериям постановкой теста Грегерсена, не требующего использования оптики (см. гл. 6). Подтверждают ферментацию лактозы до кислоты и газа.

Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой (рецепт 99).

— для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 48 ч;
— для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до температуры 43–44 °С, и инкубируют при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч.

Первичный учет образования кислоты и газа на подтверждающих полужидких средах и СИБ-лактозы (коммерческие полоски) возможен через 4–6 ч. При обнаружении кислоты и газа в среде с лактозой дают положительный ответ. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч. Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного результата оставляют для окончательного учета до 48 ч.

При лабораторно-производственном контроле качества воды поверхностных водоемов анализ может быть завершен подсчетом колоний, которые отнесены к ОКБ по двум признакам: отрицательному оксидазному тесту и ферментации лактозы на среде Эндо до кислоты и альдегида. Дальнейшее подтверждение ОКБ по способности образовывать газ на лактозных средах проводят только при отсутствии достаточно четкой дифференциации лактозоположительных колоний, при росте мелкоточечных или мелких плоских колоний, не характерных для колиформных бактерий, при небольшом опыте работы выполняющего анализ.

Учет результатов. Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37 °С с образованием кислоты и газа.

Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с образованием кислоты и газа.

При анализе питьевой воды, воды водоемов число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа в КОЕ на 100 мл воды.

Вычисление проводят по формуле:

где X – число колоний в 100 мл; V – профильтрованный через фильтры объем воды; а – число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.

При посеве по 100 мл воды на 3 фильтрах выросло две колонии на одном фильтре, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет:

При посеве 10, 40, 100 и 150 мл воды на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросло 4 изолированные колонии, с профильтрованным объемом 100 мл – 3 ОКБ. Фильтры с объемами 10 и 150 мл заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число колоний ОКБ (ТКБ) на тех фильтрах, где получены изолированные колонии, пересчитывают это число на объем 100 мл.

Питьевая вода, вода водоемов удовлетворяют требованиям в том случае, когда ОКБ и ТКБ не обнаруживают в 100 мл воды. При установлении бактериальной загрязненности воды свыше допустимых норм прибегают к повторному исследованию воды.

18.3.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Первый день: а) при исследовании питьевой воды засевают 3 объема по 100 мл (качественный метод). При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл, трех объемов по 1 мл;

б) посев воды водоемов производят в двух или трех повторностях. Воду водоемов, не загрязняемых сточными водами, засевают в объемах по 10; 1; 0,1; 0,01 мл; воду водоемов, загрязняемых сточными водами, – по 1; 0,1; 0,01; 0,001 мл; воду водоемов в зоне влияния выпусков сточных вод – в объеме по 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл.

Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозопептонную среду (рецепт 95). Посев 100 и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозопептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

Второй день. Посевы инкубируют при 37±1 °С. Не ранее 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо (рецепты 96, 97) для получения изолированных колоний.

Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными, и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 18–20 ч.

При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий (темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде), дают положительный ответ на присутствие ОКБ в данном объеме пробы.

Отрицательный ответ выдается, если в среде накопления и на секторах среды Эндо не отмечено роста; на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии; все колонии оказались оксидазоположительными; все бактерии оказались грамположительными; не отмечено газообразования в подтверждающем тесте на среде с углеводом.

Для определения секторов среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии, делают посев 2–3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред (рецепты 99, 100).

Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через 4–6 ч.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях выдают отрицательный ответ.

Для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ производят высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирке с лактозо-пептонной средой с поплавком и прогретой предварительно до температуры 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

Учет результатов. При обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из трех объемов питьевой воды выдается ответ об обнаружении ОКБ и ТКБ в 100 мл.

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ питьевой воды (табл. 18.1), воды водоемов (табл. 18.2).

Читайте также: