Установите последовательность операций при создании трансгенных растений
Добавил пользователь Alex Обновлено: 19.09.2024
Агробактериальная трансформация — метод получения трансгенных растений путём введения Агробактериума (Agrobacterium) — почвенной бактерии, образующей опухоль при заражении растений.
Внедрение в жизнь биотехнологии целенаправленного получения трансгенных растений ускорила стыковка методов получения эмбриональных тканей из растительных клеток и тканей посредством использования искусственных питательных сред, витаминов, гормонов и микроэлементов и выращивания этих тканей до зрелого растения с достижениями генетической инженерии.
Основной недостаток классического генетического метода изменения наследственности состоит в том, что при скрещивании двух организмов с разными генотипами происходит взаимная рекомбинация их ценных и не ценных в хозяйственном отношении генов. В результате в созданный сорт будут переходить, кроме тех генов, которые были желательны для генетика-исследователя, и гены, ухудшающие свойства сорта.
При применении метода агробактериальной трансформации данная проблема легко разрешается.
Заражение агробактерией
В клетку растения, сорт которого хотят улучшить, вводится ценный ген и из этой клетки выращивается зрелое растение. Для введения в клетку определённого гена в качестве векторной молекулы пользуются плазмидой почвенной бактерии Агробактериум. В природе при заражении этим видом бактерии растения повреждаются. В результате беспорядочного деления клеток заражённого растения на нем развивается опухоль, которая вызывается отрезком ТДНК (ДНК, вызывающая опухоль) генома Ti-плазмиды. В основе появления опухоли лежит встраивание ТДНК в геном растительной клетки и изменение ею свойств клетки (рис. 11). Эта особенность ТДНК широко используется в генной инженерии.
Векторные конструкции
Довольно большой размер Ti-плазмиды Агробактериума (более 20 тысяч нуклеотидных пар) несколько затрудняет её использование в генной инженерии. Поэтому для перестройки наследственности растения методом генной инженерии при помощи рестриктазы получают отрезок ТДНК, плазмиды которого соединяют с плазмидой pBR 322 (пи-би-эр 322) и клонируют. Созданная искусственная плазмида несколько меньше, чем Ti-плазмида, и использование её намного легче и эффективнее. Такие молекулы (созданные искусственные плазмиды) называются векторными конструкциями. На отрезок ТДНК векторной конструкции пересаживают растительный ген. В результате этого ТДНК теряет способность вызывать опухоль, так как она уже разделена на два отрезка чужеродным геном.
Векторная конструкция, содержащая расчленённые ТДНК и чужеродный ген, внедряется в безвредные для растения специальные штаммы Агробактериума, Ti-плазмида которого не содержит ТДНК. При заражении растений этими бактериями Ti-плазмида Агробактериум с помощью своего специального аппарата трансформации встраивает чужеродный ген в геном растения. В последние годы разработаны методы внедрения в растительную или животную клетку чужеродного гена в составе векторной конструкции с помощью сверхмощного электрического поля или генных пушек. Однако эти методы применяются только в особых случаях из-за их технической сложности и дороговизны.
Одним из исходных научных положений метода, позволившего осуществлять различные действия с генами, является открытие ферментов, названных рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты способны распознавать определенную последовательность
Сшивка фрагментов ДНК, полученных при помощи рестриктаз, производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК:
Векторными молекулами, или векторами, называют молекулы ДНК, способные акцептировать (от лат. acceptus – принятый) чужеродную ДНК и обеспечивать ее репликацию (от позднелат. replicatio – повторение, удвоение молекул ДНК (у некоторых вирусов РНК) при участии специальных ферментов; репликацией называется также удвоение хромосом, в основе которого лежит репликация ДНК; репликация обеспечивает точное копирование генетической информации, заключенной в молекулах ДНК, и передачу ее от поколения к поколению), возможно, и экспрессию (экспрессия гена – проявление генетической информации, записанной в гене, в форме рибонуклеиновой кислоты, белка и фенотипического признака). Векторы позволяют осуществить введение в клетку дополнительной генетической информации. В качестве векторов используют, как правило, плазмиды, бактериофаги, вирусы животных.
К векторной молекуле предъявляются следующие требования:
– вектор должен реплицироваться в определенных клетках;
– в составе векторной молекулы должен быть маркерный (от франц. marquer - отмечать) ген, который после проникновения вектора в клетку придает ей фенотип (в биологии – совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития), свидетельствующий о присутствии вектора. В качестве маркерного гена, как правило, используют гены устойчивые к антибиотикам, чаще всего устойчивые к ампициллину. При создании трансгенных растений применяют природный генный вектор, возникший в организме почвенных бактерий (Agro-bacteria).
Сущность этого способа состоит в том, что Т-ДНК с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды и вставляют в вектор для клонирования в Е. cоli например pBR 322. Плазмиду с Т-ДНК размножают и, используя стандартные методы, встраивают чужеродный ген внутрь Т-области и вновь размножают с уже вставленным геном. Затем полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefacience, несущую полную Ti-плазмиду.
В результате двойной рекомбинации между гомологичными (от греч. homologos – соответственный, подобный), областями Т-ДНК часть рекомбинантной плазмиды, которая содержит чужеродный ген, включится в Ti -плазмиду, заместив в ней нормальную Т-ДНК. Бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенными генами, заражают растения, в результате чего образуются опухоли – корончатый галл. Начинается перестройка метаболизма клеток, которые будут содержать Ti-область со встроенным в него чужеродным геном.
Если вам нужна помощь в написании работы, то рекомендуем обратиться к профессионалам. Более 70 000 авторов готовы помочь вам прямо сейчас. Бесплатные корректировки и доработки. Узнайте стоимость своей работы.
Существуют и другие методы введения чужеродной генетической информации: применение бинарных векторов; векторов на основе ДНК-содержащих вирусов растений; прямого переноса генов. Метод биологической баллистики является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации однодольных.
Сущность этого метода заключается в том, что на мельчайшие частицы золота или вольфрама, диаметром 0,6–1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые или золотые частицы, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помешаются внутрь биологической баллистической (биолистической) пушки. Они с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. С помощью биолистической пушки были протрансформированы однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При этом были получены стабильные растения трансформанты.
1) плазмиды агробактерийAgrobacterium tumefaciens,которые являются естественным вектором для горизонтального переноса генов у двудольных растений. Эти бактерии вызывают образование опухолей стебля двудольных растений - корончатых галлов. Причиной опухолеобразования являются так называемые Ti-плазмиды (от англ. tumor inducing- индуцирующая опухоль. Ti-плазмида проникает из клетки бактерии в растение и часть ее, называемая Т-ДНК (от англ. transferred DNA- переносящаяся), ковалентно встраивается в хромосомы инфицируемого растения.
Размер всей Ti-плазмиды составляет 200-250 тпн, размер T-ДНК в разных плазмидах варьирует от 10 до 30 тпн (что составляет примерно 10% Ti-плазмиды). На T-области картировано не менее 7 генов, каждый из которых регулируется собственным промотором (что сходно с генами эукариот). Эти гены отвечают за синтез опинов (тип которых, например, нопалин, октопин, агроцинопин, манопин зависит от штамма агробактерии, вызывающего его образование) и подавление дифференцировки клеток (онкогены) - подавление образования корней и побегов. Эти гены функционируют лишь после их переноса в растительную клетку. С концов T-ДНК ограничена правым и левым прямыми повторами из 25 пн, что придает ей сходство с мобильными генетическими элементами. Поэтому любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за T-ДНК и перенесена в растительную клетку. Важно отметить, что все гены (их около 35), ответственные за перенос и интеграцию T-ДНК, находятся не в T-ДНК, а в области вирулентности (vir-область).
Однако практическое использование природных Ti-плазмид как векторов для переноса генетической информации в растительные клетки и клонирования генов затруднено из-за ее больших размеров (до 250 тпн, тогда как для прокариот вектор pBR322 имеет размеры всего 4,4 тпн). Учеными были разработаны различные стратегии введения чужеродных генов в состав T-ДНК, одна из которых, нашедшая широкое применение, - создание бинарной векторной системы. В этом случае конструируют два вектора, один из которых содержит область T-ДНК, а другой - гены vir-области, обеспечивающие все функции переноса T-ДНК в геном растительных клеток. Трансгены, кодирующие хозяйственно ценные признаки, встраивают в T-ДНК. Эта же область снабжается маркерными генами, эукариотическим промотором и уникальными сайтами рестрикции. Причем, гены, подавляющие дифференцировку растительных клеток и вызывающие развитие опухоли (онкогены), инактивируются или вырезаются, вследствие чего рост трансформированных растений не нарушается.
В последние годы для создания искусственных векторов используется Ri-плазмида (от англ. root inducing - индуцирующая корни), присутствующая в штаммах Agrobacterium rhizogenes. Ri-плазмиды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они являются естественными безвредными векторами, т.е. после встраивания T-ДНК в хромосомную ДНК растительных клеток в области заражения наблюдается усиленное образование корешков ("бородатость"), из которых легче регенерировать здоровые плодовитые растения, чем из недифференцированной ткани опухоли.
Необходимым условием для инфекции Ti-плазмиды является поранение растения. Поэтому агробактерии, содержащие рекомбинантные плазмиды, наносят на срезанную часть растения (например, побег) или осуществляют совместное культивирование (кокультивирование) агробактерий и стерильного растительного материала (например, сегментов междоузлий, листовых дисков, протопластов) на питательных средах в условиях in vitro.
2) Прямой физический перенос ДНК в клетку, который используется для трансформации устойчивых к агробактериям растений. Сюда включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом. Наиболее продуктивным и чаще всего используемым является метод бомбардировки микрочастицами. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Этим же методом можно трансформировать и другие ДНК-содержащие клеточные органеллы - хлоропласты и митохондрии
3) Использование антисмысловых (перевернутых)РНК что позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора к-ДНК встраиваемого гена переворачивают на 180°. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется.
Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена, контролирующего синтез полигалактуроназы - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибковым заболеваниям.
Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген, продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен - это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов.
Cтратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений.
4) Агролистический метод трансформации (комбинированный) При этом чужеродная ДНК вводится в ткани каким-либо физическим методом, например, баллистическим. Вводимая ДНК включает как вектор с целевым и маркерным геном, так и агробактериальные гены вирулентности, поставленные под эукариотический промотор. Временная экспрессия генов вирулентности в растительной клетке приводит к синтезу белков, которые правильно вырезают Т-ДНК из плазмиды и встраивают ее в хозяйский геном, как и при обычной агробактериальной трансформации.
5) ДНК-инсерционный мутагенез. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты, используя явление сайлесинга – замолкания генов. На основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу, а также трансгенные растения с измененными декоративными свойствами (растений петунии с разноцветными цветками), голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума.
После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.
Обзор
Есть или не есть ГМО? В этом вопрос.
Автор
Редакторы
Немного истории
На самом деле, фермеры изменяли генетический аппарат растений уже тысячи лет. Интуитивно скрещивая друг с другом определенные растения с наилучшими свойствами, фермеры заметили, что эти свойства сохраняются в потомстве. Так зарождалась селекция. После того, как в начале XX века наука взяла на вооружение генетические законы Менделя, работа селекционеров значительно упростилась. А уже в конце 20-х годов ΧΧ века исследователи обнаружили, что можно улучшить нужные свойства растений с помощью мутаций. Количество мутаций можно было увеличить с помощью рентгеновских лучей и различных химикатов. В результате таких экспериментов было получено около двух десятков различных сортов растений для пищевых целей, и такие эксперименты продолжаются и сегодня [1]. Но данный метод дает довольно непредсказуемые результаты, ведь мутации спонтанны, и сложно предугадать, какая получится — полезная или нет.
Рисунок 1. Человек занимался модификацией растений еще с древних времен. Иначе откуда у нас столько сортов каждого овоща или фрукта?
Но уже в 1981 году Шелл и его команда создала первое трансгенное растение — новый сорт табака — с помощью методик генной инженерии. С тех пор многие лаборатории по всему миру пользуются этим методом, создавая новые трансгенные растения, благодаря которым может быть побежден голод и загрязнение планеты неумеренным использованием удобрений [2].
Генетически модифицированные растения — это растения, генотип (то есть, совокупность всех генов) которых был искусственно изменен с помощью генной инженерии. Генетическая модификация отличается целенаправленным изменением генотипа организма в отличие от случайного изменения, характерного для естественного и искусственного мутационного процесса [3].
Этапы создания генетически модифицированных растений
- Получение изолированного гена. Мы получаем нужный ген либо путем химического синтеза из составляющих ДНК нуклеотидов (что очень долго и дорого, а потому обычно нецелесообразно), либо путем его выделения из клеток других организмов с помощью специальных методик.
- Введение гена в вектор для переноса в организм. Вектор — структура, переносящая в клетку соответствующую генетическую информацию, в данном случае тот полезный ген, который был выделен в пункте 1. Обычно в виде векторов используют плазмиды или инактивированные оболочки вирусов. Для трансформации растений иногда также используют липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина.
- Перенос вектора с геном в модифицируемый организм с помощью различных манипуляций. В зависимости от используемых клеток и векторов манипуляции могут быть самые разные — от простого капания вектора на необходимые клетки до обстрела клеток вектором из генной пушки.
- Выращивание растений из модифицированных клеток.
- Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.
Предположим, что создание трансгенного организма завершено (см. врезку), осталось посадить его и вырастить. Но нужно ли это делать?
Почему мы боимся трансгенных растений и оправдано ли это?
Применение трансгенных растений в сельском хозяйстве возбудило опасения и недовольство общества относительно их возможного влияния на дикую природу, здоровье человека и экологию. Например, дебаты разгорелись после публикации результатов лабораторных исследований, в которых пыльца трансгенной кукурузы убивает гусениц бабочки-монарха. Хотя вскоре после этого Агентство по охране окружающей среды США показало, что вероятность влияния кукурузы на личиночную стадию бабочки совершенно незначительна в естественных условиях или вовсе отсутствует из-за различных мест их обитания [5].
Или нашумевший эксперимент с крысами. Животных кормили трансгенной кукурузой, и у них стали появляться опухоли. Но исследователи использовали крыс линии Спраг Доули, которые в норме дают опухоли у 80% популяции. Эксперимент был опровергнут многими учеными, так как не была установлена зависимость от количества потребления кукурузы, не было контрольной линии крыс и возникало множество вопросов о правильности постановки эксперимента [6]. Но все же именно этот опыт с крысами дал достаточно сильный резонанс в обществе и подтолкнул общественность к резко негативному настрою против генно-модифицированных растений.
Рисунок 2. Крысы — одни из основных лабораторных животных. Есть множество линий этих грызунов, и многие из них отличаются серьезными особенностями физиологии. Поэтому при любом эксперименте важно правильно подбирать подопытных животных, а также проводить такое исследование, чтобы оно могло быть принято и учеными сообществом, и населением планеты.
Как трансгенные растения могут спасти экологию и людей от постоянного отравления?
ΧΧ век был веком торжества химии. Именно тогда активно применялись многие пестициды — вещества различной химической природы, используемые для защиты культурных растений от сорняков, вредителей и болезней, т.е. химические средства защиты растений. Однако для человека эти вещества могут быть вредны.
Несмотря на то, что используется много способов для очищения продуктов питания от пестицидов, они все равно так или иначе попадают на стол потребителя — через растения, которые впитали их с водой из почвы; через молоко или мясо коров и других животных, которые съели опрысканные химикатами растения; через воду, которая принесла в городскую систему водоснабжения пестициды с опрысканных полей. Пестициды будут присутствовать в продукте даже при интенсивной физической обработке, так как не разрушаются ни при высокой температуре, ни при консервации. Ни один производитель не напишет на упаковке, что в его продукте присутствуют пестициды, а они там всегда есть, хотя бы в очень малых количествах; за последние 10 лет уровень пестицидов в продуктах увеличился в 5 раз [5]. Впору задуматься. А ведь именно ненавистные многим генно-модифицированные растения могут спасти человека от ежедневного поедания химикатов.
Основной способ исключить использование пестицидов — это создать растения, устойчивые к насекомым-вредителям. Создание этой устойчивости включает в себя внедрение в генотип растения гена, отвечающего за синтез вещества, которое пагубно действует на насекомых. Были проведены исследования, которые доказали, что это вещество никак не действует на птиц, млекопитающих и человека, зато насекомые, пытающиеся съесть такое растение, погибают [4]. Именно этот способ борьбы с насекомыми спасает ежегодно многие гектары посевных площадей без вреда для окружающей среды, человека и животных.
Рисунок 3. Нерегулируемое распыление пестицидов на поле. Откуда вы знаете, что ветер или вода не занесет химикаты на ваш стол, в ваши форточки или в вашу питьевую воду?
Растения, которые спасают десятки тысяч жизней
Очень часто можно слышать или читать о вреде трансгенных растений, о подозрительных экспериментах, проводимых над животными, но почему-то обычно на второй план уходит одна из главных задач этих организмов, с которой они замечательно справляются — спасение от голода и нехватки жизненно важных питательных веществ жителей нашей планеты. Количество населения растет с каждым годом: нас уже больше 7 миллиардов [7], и традиционное сельское хозяйство не может прокормить такое количество народа. Вспомним трансгенные растения, благодаря которым удалось спасти миллионы жизней.
Рисунок 4. Обыкновенный (слева) и золотой (справа) рис. Первый шаг к спасению от мирового голода и дефицита незаменимых веществ.
Опасны ли трансгенные растения для человека и экосистемы?
Каждый интересующийся темой трансгенных растений слышал ужасающую историю о том, что части их ДНК могут встраиваться в человеческие хромосомы и вызывать невероятные, опасные для жизни мутации. Вряд ли сейчас кто-либо может дать ответ, где и когда появилась эта идея, но разъяснить ее необходимо.
Рисунок 5. Строение ДНК — от хромосомы до нуклеотида. Строение ДНК одинаково у всех организмов независимо от их вида, происхождения или модификации. А пищеварительная система человека устроена именно так, чтобы разбить любую попадающую в нее ДНК на ее составляющие — нуклеотиды.
Первой проблемой обеспокоено много ученых, ведь, на первый взгляд, все трансгенные растения приспособленнее своих диких собратьев. Но на деле это те же культурные сорта растений, которым необходим уход и забота со стороны человека, иначе их вытеснят сорняки [10]. Да, проблема является до сих пор открытой и вызывает множество споров; однако заметим, что за тридцатилетнюю историю культивирования трансгенных растений ни одно из них еще не встречалось в дикой природе.
Делая обзор о проблемах генно-модифицированных растений, всегда необходимо упоминать об экологических проблемах, о рисках влияния на окружающую среду. Но вряд ли риски генно-модифицированных растений сравнятся с рисками выбросов химических соединений, используемых при традиционном культивировании растений, в атмосферу и воду.
Какое будущее нас ждет?
Население нашей планеты неуклонно растет, а каждый новый человек требует ресурсов для жизни. Традиционное сельское хозяйство, в частности растениеводство, не может удовлетворить потребности всех людей, и поэтому его приходится совершенствовать. Новое всегда пугает и вызывает опасения. В начале развития компьютеров человечество боялось их; так и теперь боится новых, непонятных достижений генной инженерии. Общество подозрительно, люди хотят знать, что они едят. И это правильно, но отказываться от новых способов прокормить миллиарды человек было бы совершенно неразумно, особенно если учесть тот факт, что на данный момент это единственное разрешение проблемы голода и недостатка важнейших питательных веществ для людей во всем мире. Главное — не бояться видеть в новом положительное, узнавать о нем все, что можно узнать, и делать выводы на достоверных фактах. Тогда мы сможем спастись от множества заблуждений.
Читайте также: