Учесть биохимические свойства культуры в цветном ряду с посевами sh flexneri
Добавил пользователь Валентин П. Обновлено: 19.09.2024
Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. Она позволяет установить видовую и типовую принадлежность, определить биологические варианты микроба. Существует целый ряд ферментов, по активности которых можно определить степень патогенности микроорганизма.
Для определения ферментативной (биохимической) активности микробов используют дифференциально – диагностические среды.
К дифференциально – диагностическим средам относятся среды Гисса, на которых изучается сахаролитическая активность микрооганизмов.
Среды Гисса могут быть жидкими и плотными. Основу сред Гисса составляют мясо – пептонный бульон (МПБ) и мясо – пептонный агар (МПА). В состав этих сред входит углевод и индикатор. Существуют два ряда сред Гисса – большой (включающий 27 наименований) и малый. Малый ряд сред Гисса включает мальтозу, глюкозу, сахарозу, манит и лактозу. Исходная установка рН среды – слабо щелочная (7,2 – 7,4).
Если при культивировании микробов происходит расщепление субстрата до кислоты, то рН среды изменяется в кислую сторону и при этом происходит изменение цвета индикатора. Изменение цвета питательной среды и является показателем наличия у данного микроба фермента, расщепляющего конкретный субстрат до кислоты. И в жидкой, и в плотной питательной среде о наличии фермента, расщепляющего субстрат до кислоты, судят по изменению цвета индикатора.
Образование газа устанавливают по скоплению пузырьков газа в толще агара и по разрыву агара (если среды Гиса плотные) или по скоплению пузырьков газа в поплавке (если среды жидкие). Поплавок – узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращенным вверх, которую помещают в пробирку со средой перед стерилизацией среды.
Различие в наборе ферментов, расщепляющих углеводы, может быть использовано при дифференцировке родственных микробов, например, сальмонелл, шигелл, эшерихий. Так, на средах Эндо, Левина, Плоскирева, в состав которых входит лактоза и индикатор (анилиновый краситель), колонии кишечной палочки будут окрашены в фиолетовый цвет (на среде Левина) или в сиреневый (на средах Эндо и Плоскирева). Колонии сальмонелл и шигелл на этих же средах будут бесцветными.
Это обусловлено тем, что кишечная палочка, имея фермент лактазу, расщепляет лактозу, в результате чего образуется кислота, рН среды смещается в кислую сторону и происходит проявление цвета индикатора – анилинового красителя. Особи кишечной палочки хорошо окрашиваются анилиновым красителем, а совокупность окрашенных особей представляет окрашенную колонию.
Шигеллы и сальмонеллы не имеют фермента лактазы и не расщепляют лактозу, рН среды не изменяется, индикатор не проявляется, микробные клетки не окрашиваются. Поэтому колонии сальмонелл и шигелл на средах Эндо и Плоскирева будут бесцветными.
О наличии фермента амилазы можно судить, посеяв культуру на среду, содержащую крахмал. Если есть фермент, расщепляющий крахмал, то при добавлении в пробирку капли раствора Люголя, посинение среды не произойдет. Нерасщепленный крахмал при добавлении раствора Люголя дает синее окрашивание.
Протеолитические свойства (т.е. способность расщеплять белки, полипептиды и пр.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих желатин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен.
При расщеплении пептоном могут выделяться индол, скатол, сероводород, аммиак. Их образование устанавливают с помощью индикаторов. Например, фильтровальную бумагу заранее пропитывают раствором индикатора, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5 – 6 см и после посева культуры на МПБ помещают под пробку (между пробкой и стенкой пробирки). После инкубации в термостате учитываю результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной 20% раствором ацетата свинца и гидрокарбоната натрия, происходит образование сульфата свинца – соли черного цвета, и индикаторная бумажка чернеет. Индол способствует покраснению бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты.
Гемолитические свойства микробов можно выявить, используя кровяной агар. Если микроб имеет фермент гемолизин, то вокруг колоний этого микроба будут зоны лизиса эритроцитов ( в этих зонах агар будет бесцветным).
Фермент лецитиназу выявляют при посеве культуры на желточно – солевой агар. Вокруг колонии микроба, продуцирующего этот фермент, образуется матовый ореол.
Следует помнить о том, что наличие различных ферментов определяет биохимические свойства микробов. Ферментный состав любого микроорганизма является достаточно постоянным признаком в нормальных условиях, т.е. различные виды микроорганизмов различаются по набору ферментов.
Изучение ферментного состава имеет важное значение для дифференцировки и идентификации различных микроорганизмов.
Качество лабораторной диагностики во многом зависит от правильного сбора материала для исследования и посева его на соответствующие среды. Материалом для исследования служат фекалии. Посев на элективные дифференциально-диагностические среды (среду Плоскирева, агар Мак-Конки и др.) лучше производить у постели больного. Засеянные чашки сразу же отправляют в лабораторию. Для посева отбирают частицы кала, содержащие слизь и гной. В качестве среды обогащения используют только жидкую селенитовую среду.
Второй день:
1. Просматривают чашки, засеянные накануне. Отбирают подозрительные колонии для дальнейшего исследования. На указанных выше питательных средах шигеллы образуют небольшие (до 1,5 мм в диаметре) бесцветные нежные слегка выпуклые колонии. S. sonnei могут образовывать наряду с описанными и более крупные плоские с неровным краем колонии.
2. Отобранные колонии петлей засевают в пробирку с полужидким агаром для определения подвижности (под пробку помещают индикаторную бумажку для определения индола), в пробирку со средой Клиглера (не забыть проколоть нескошенную часть среды — столбик), в среду с мочевиной по Преусу в пробирке, в пробирку с нитратным агаром Симмонса, на среду Кларка.
Третий день:
1. Просматривают чашки с посевами среды накопления. Отбирают подозрительные колонии и засевают на тот же ряд сред, что и с первичного посева во второй день.
2. Учитывают результаты посева для определения ферментативных свойств, сделанного на второй день. Неподвижные, ферментирующие глюкозу с образованием кислоты (некоторые биотипы S. flexneri 6 расщепляют глюкозу до кислоты и газа), не ферментирующие лактозу (следует помнить, что среди S. sonnei встречаются биохимические варианты, замедленно ферментирующие лактозу до кислоты), не образующие сероводорода, не гидролизующие мочевину, не утилизирующие цитрат в качестве единственного источника углерода, дающие положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную Фогеса-Проскауэра подозрительны на шигеллы.
Четвертый день:
1. Учитывают результаты посевов, сделанных накануне, и окончательно идентифицируют выделенные культуры по биохимическим свойствам.
2. Культуры, биохимические свойства которых соответствуют характеристике шигелл, типируют в реакции агглютинации на стекле сначала со смесью № 1 (поливалентная сыворотка к шигеллам Флекснера и Зонне), а при отрицательной реакции — с набором поливалентных сывороток к другим видам шигелл.
В случае выявления положительной реакции с одной из поливалентных сывороток типирование продолжают с адсорбированными моновалентными сыворотками, при выделении шигелл Флекснера — с типовыми и групповыми сыворотками.
По результатам изучения биохимических свойств и серологического типирования выдают ответ о выделении определенного вида шигелл.
В настоящее время все чаще стали использовать ПЦР и разные иммунологические методы для обнаружения последовательностей ДНК и специфических шигеллезных антигенов в материале (ИФА, иммунофлюоресцентный метод), позволяющие подтвердить диагноз в первые дни заболевания.
5 группа по Берджи – факультативно-анаэробные Грам- палочки Семейство : Enterobacteriaceae Род : Shigella Виды : Подгруппа А – Sh. dysenteriae ( 12 сероваров, 1-ый – Григорьева-Шига ) Подгруппа В – Sh. flexneri ( 6 сероваров, 6-ой - Ньюкастл ) Подгруппа C – Sh. boydii ( 18 сероваров ) Подгруппа D – Sh. sonnei ( нет сероваров, есть хемовары и фаготипы )
Слайд 3: Морфологические и тинкториальные свойства
Мелкие палочки с закругленными концами Грамотрицательные Спор не образуют Неподвижны Не образуют капсулу (м.б. микрокапсула)
Слайд 4: Культуральные свойства
Хорошо растут на простых питательных средах Рост в бульоне в виде диффузного помутнения Селективные среды : Мюллера : МПБ Мел Раствор Люголя Гипосульфит Na Селенитовый бульон : МПБ Фосфат Na Селенисто-кислый Na Затем пересевают на дифференциально-диагностические среды : Эндо Левина Плоскирева (предпочтительнее) Колонии шигелл мелкие (1,0 – 1,5 мм), округлые, с ровным краем, блестящей поверхностью, прозрачные, бесцветные, т.к. шигеллы не расщепляют лактозу ( лактозонегативные ) (кроме Sh. sonnei ) (см. ниже)
Слайд 5: Биохимические свойства
Ферментируют глюкозу с образованием кислоты без газа, за исключением Sh. newcastle – до К и Г НЕ ферментируют лактозу, за исключением Sh. sonnei – ферментирует медленно (более 48 часов) НЕ образуют H 2 S НЕ разжижают желатин Могут образовывать индол
Слайд 6: Антигенные свойства
О-АГ : Родоспецифические Видоспецифические Группоспецифические Типоспецифические К-АГ
Слайд 7
Эпидемиология шигеллёза Источник человек (антропоноз) больной или бактерионоситель Пути передачи : механизм – фекально-оральный ; пути : 1. алиментарный (пищевой) (для Sh. sonnei ) 2. контактно-бытовой (для Sh. dysenteriae ) 3. водный (для Sh. flexneri ) Восприимчивый коллектив – любой человек (после заболевания – стойкий типоспецифический иммунитет)
Слайд 8: Факторы патогенности шигелл
Факторы адгезии и колонизации пили белки наружной мембраны клеточной стенки муциназа Факторы инвазии и ферменты белки наружной мембраны – инвазины гиалуронидаза нейраминидаза Защита шигелл от фагоцитоза (агрессины) поверхностный К-антиген ЛПС Токсины 1. Эндотоксин ЛПС 2. Экзотоксины состоят из субъединиц А и В. Рецептором для токсинов служит гликолипид мембраны клетки. Энтеротоксин стимулирует активность аденилатциклазы и отвечает за развитие диареи. Токсин Шига ( нейротоксин ) и шигаподобные ( SLT-I и SLT-II ) оказывают прямое цитотоксическое действие.
Слайд 9
Варианты заболевания: Проходят транзитом, не вызывая заболевания, при низкой инфицирующей дозе, воздействии нормальной микрофлоры и факторов местного иммунитета – транзиторное бактерионосительство Шигеллы (чаще Sh. s onnei ) размножаются в основном в тонком кишечнике – острый гастроэнтерит – шигеллез, протекающий по типу пищевой токсикоинфекции Поражение толстого кишечника, возникает колитический синдром, типичная острая дизентерия. Имеют место явления общей интоксикации, а если поражение вызвано шигеллой Григорьева – Шига – нейротоксикоз.
Слайд 10: Патогенез дизентерии
Проникновение шигелл per os Попадание в толстый кишечник (м.б. поражение тонкого кишечника) Адгезия к колоноцитам, колонизация, внедрение в колоноциты В колоноцитах размножаются, выделяют токсины Цитотоксины Гибель клеток, поражение нервного сплетения Выход ионов и воды в просвет кишечника Диарея (частота – до 50 раз в сутки) Активация аденилатциклазы Энтеротоксин Язвы в стенке кишки, кровь и слизь в кале, тенезмы, ложные позывы к дефекации
Слайд 11: Лабораторная диагностика
Исследуемый материал : испражнения Экспресс – метод РНТФ с индикаторными дизентерийными бактериофагами РИФ с люминесцирующей дизентерийной сывороткой Чувствительность этих реакций не очень высока, т.к. для их учета необходима большая концентрация шигелл в исследуемом материале: для РНТФ – 10 4 кл /г, для РИФ – 10 7 кл /г.
Слайд 12: Лабораторная диагностика
Микроскопический метод (низкая диагностическая ценность) окраска по Граму : грамотрицательные мелкие палочки
Слайд 13: Лабораторная диагностика
Бактериологический метод - основной Испражнения засевают на селективные среды : Мюллера : МПБ Мел Раствор Люголя Гипосульфит Na Селенитовый бульон : МПБ Фосфат Na Селенисто-кислый Na Затем пересевают на дифференциально-диагностические среды : Эндо Плоскирева (предпочтительнее) Характер роста шигелл : Колонии шигелл мелкие (1,0 – 1,5 мм), округлые, с ровным краем, блестящей поверхностью, прозрачные, бесцветные, т.к. шигеллы не расщепляют лактозу ( лактозонегативные )
Слайд 14: Колонии шигелл на среде Эндо
Слайд 15
Из лактозонегативных колоний : мазок, окраска по Граму определение подвижности Пересев на среду Ресселя для выделения чистой культуры Среда Ресселя : МПА 1% лактозы 0,1 % глюкозы Индикатор бромтимоловый синий Среда имеет столбиковую и скошенную часть При росте шигелл столбик желтеет, а скошенная часть остаётся первоначального травянисто-зелёного цвета
Слайд 16: Рост на среде Ресселя
1. Незасеянная среда 2. Shigella 1 2
Слайд 17
Слайд 18
Коммерческие микрообъемные тест-системы для биохимической идентификации энтеробактерий : содержат субстрат реакции и индикатор в питательной среде или в шаблоне-носителе (например, на бумажных дисках, которые вносят в лунки). Результаты биохимических тестов учитываются визуально, вид микроорганизма устанавливается с помощью таблицы идентификации, кодов (профилей) или компьютерных программ.
Читайте также: