Среда для первичного посева на стафилококк

Добавил пользователь Дмитрий К.
Обновлено: 19.09.2024

В препарате из чистой культуры видны грамположительные кокки, располагающиеся скоплениями в виде “виноградных гроздьев”. Могут встречаться единичные кокки или маленькие кучки.

2. Изучение мазков из гноя, окрашенных по Граму (зарисовать)

В мазке, на фоне клеточного детрита, окрашенного в розовый цвет, видны лейкоциты и грамположительные кокки, расположенные одиночно или небольшими кучками, не образующие капсул. Расположение кокков позволяет предположить длительность заболевания. Если заболевание свежее, то микробы располагаются внеклеточно, в более поздние сроки болезни можно наблюдать кокки, фагоцитированные лейкоцитами.

3. Изучение характера роста стафилококков на кровяном агаре (зарисовать)

Посев на кровяном агаре позволяет определить тип гемолизина, выделяемого стафилококками. Гемолитическая активность является одним из признаков патогенности стафилококков. Для приготовления кровяного агара, к 1,8 % МПА расплавленного и остуженного до 45–50 градусов добавляют 5% дефибринированной или свежевзятой крови животного (кролика, барана, крупного рогатого скота) или человека. После тщательного перемешивания агар разливают по чашкам. Гемолизин стафилококков вызывает растворение стромы эритроцитов, поэтому вокруг колоний стафилококков, обладающих гемолитической активностью, образуются светлые зоны гемолиза. Штаммы, образующие альфа-гемолизин, вызывают гемолиз кроличьих и бараньих эритроцитов, бета-гемолизин вызывает тепло-холодовой гемолиз только бараньих эритроцитов. Вокруг колоний стафилококков без гемолитической активности кровяной агар не изменен.

4. Изучение характера роста стафилококков на желточно-солевом агаре (ЖСА) (зарисовать)

Посев на желточно-солевом агаре проводят для определения лецитовителлазы (лецитиназы). Для приготовления ЖСА к 10% солевому агару, расплавленному и остуженному до 60 градусов, добавляют 10% желточной взвеси (1 желток асептично взбалтывают в 200 мл физиологического раствора), агар тщательно смешивают и разливают в чашки.

St.aureus образует на желточно-солевом агаре непрозрачные круглые, слегка выпуклые колонии золотистого или желтого цвета. Среда вокруг колоний мутнеет за счет расщепления липовителлина (комплекс жира и белка), содержащегося в желтке ферментом лецитиназой. В результате действия фермента от липовителлина отрываются жирные кислоты, степень дисперсности белка уменьшается, происходит преципитация его, что приводит к помутнению среды. Освобождение жирных кислот сопровождается образованием “радужного” ореола вокруг колоний (лецитиназоположительные стафилококки).

St.epidermidis на желточно-солевом агаре образует колонии белого цвета или лимонно-желтые с ровным краем, среднего размера. Среда вокруг колоний не изменена (лецитиназоотрицательные стафилококки).

5. Изучение характера роста стафилококков на молочно-солевом агаре (зарисовать)

St.aureus образует колонии золотистого цвета средних размеров, блестящие, выпуклые. St.epidermidis образует подобные колонии белого цвета. St. citreus (только как образующий пигмент) образует подобные колонии лимонно-желтого цвета.

6. Изучение лабораторной диагностики стафилококковых инфекций по схеме (зарисовать)

Основные методы микробиологического исследования:

Микроскопический метод. Метод основан на обнаружении стафилококков при микроскопическом исследовании мазков из материала, которые окрашивают по Граму. Под микроскопом изучают гной, отделяемое ран, слизь и налеты с миндалин и другой материал, содержащий большое количество микробов. Микроскопическое исследование крови не производят, так как кокки в мазках обнаружить не удается. Жидкий материал наносят на предметное стекло пипеткой или петлей. Густой материал растирают на стекле в капле воды, материал с тампона размазывают по стерильному предметному стеклу. В мазках обнаруживают грамположительные кокки среди лейкоцитов или внутри них. Отмечают степень обсемененности. Определить вид кокков в мазке не всегда удается, поэтому микроскопическое исследование носит ориентировочный характер. Но даже обнаружение в материале типичных по морфологии стафилококков не позволяет поставить диагноз инфекции, потому что присутствие стафилококков в исследуемом материале не всегда является доказательством его этиологической роли, по морфологии невозможно отдифференцировать патогенные стафилококки от непатогенных. Поэтому наряду с микроскопическим исследованием обязательно проводят бактериологическое исследование.

Бактериологический метод. Бактериологический диагноз основан на выделении чистой культуры стафилококка путем посева и определения его патогенных свойств. Этот метод используется также для установления источника инфекции факторов передачи инфекции, определения схемы антибактериальной терапии, ее эффективности, контроля за лечением и эпидемическим режимом в лечебных учреждениях. Важным условием бактериологической диагностики является определение качественных и количественных критериев содержания патогенного стафилококка.

Исследование гноя (слизи из носа или зева, налета)

Для посева материала выбирают необходимые питательные среды. Стафилококки к питательным средам неприхотливы и способны расти на МПА. Но для повышения высеваемости и возможности провести количественный учет и надежно отличить патогенные стафилококки от непатогенных используют элективные питательные среды. В качестве элективных сред используют молочно-солевой, желточно-солевой агар или молочно-желточно-солевой агар. Элективность этих сред обеспечивается высоким содержанием хлорида натрия (6,5–10%), добавленное молоко позволяет определить цвет образуемого пигмента, а яичный желток – выявить лецитовителлазную (лецитиназную) активность, которая является одним из факторов патогенности стафилококков.

Для посева материала используют также кровяной агар, который дает возможность определить наличие пигмента и гемолитическую активность. Однако нужно помнить, что результат исследования (наличие гемолитической активности) зависит от вида крови, ее концентрации, густоты крови, присутствия и характера сопутствующей флоры. Поэтому использование кровяного агара рекомендуется для первичного посева материала, не содержащего другой микрофлоры.

Для оценки обсемененности производят количественный посев материала, готовя из него разведения, и высевают по 0,1 мл из разведений десять во второй, десять в четвертой и десять в шестой степенях. С тампона засевают цельный материал. Посевы на ЖСА инкубируют в течение 2 суток, а на кровяном агаре – 18–20 часов.

Так как ЖСА является элективной средой, то на нем вырастают только колонии стафилококков. Обращают внимание на наличие лецитиназоположительных колоний, подсчитывают их, отбирают 2-3 колонии для дальнейшего исследования. Если на ЖСА вырастают только лецитиназоотрицательные стафилококки, то из посева тоже отбирают не менее 2 колоний. И лецитиназоположительные и лецитиназоотрицательные стафилококки отсевают на скошенный мясопептонный агар. После суточного инкубирования выделенную культуру изучают в мазках, окрашенных по Граму, определяя морфологию микробов и чистоту культуры. При наличии в мазке грамположительных кокков, расположенных характерными гроздьями, проводят исследование для идентификации стафилококков. Согласно генотипической классификации род Staphylococcus относится к семейству Staphylococcасеае, класс Bacilli, в которое входят также роды: Jeotgalicoccus, Macrococcocus, Nosocomiicoccus, Salinicoccus. Общими признаками для представителей этого семейства является то, что все они грамположительные кокки. Для установления принадлежности к роду Staphylococcus проводится первичная идентификация по наличию каталазы и способности ферментировать глюкозу в анаэробных условиях.

Стафилококки ферментируют маннит в анаэробных условиях (табл.10). Микрококки не ферментируют глюкозу в анаэробных условиях, так как они облигатные аэробы.

Микроскопия золотистого стафилококка. Выявление скоплений грамположительных кокков и полиморфно-нуклеар-ных лейкоцитов при исследовании окрашенных мазков клинического материала может служить основанием для предварительного диагноза. Следует помнить, что результаты микроскопии нельзя считать достаточными для выдачи окончательного заключения.

Выделение золотистого стафилококка

Посев золотистого стафилококка проводят на простые питательные среды, обычно на тио-гликолевую среду и КА. Если существует риск контаминации образца, применяют дифференциально-диагностические среды. Наиболее часто используют молочно-солевой (или молочно-жел-точно-солевой) агар и солевой агар с маннитом, на них рост контаминирующей микрофлоры угнетает высокая концентрация NaCl. Кроме того, на молочно-солевом агаре (МСА) хорошо проявляется способность к пигментообразованию и разложению лецитина (лецитовителазная активность). В последнее время широкое распространение в качестве дифференциально-диагностической среды нашёл агар с колистином и налидиксовой кислотой.

Стафилококки хорошо растут на бульоне, сначала вызывая его равномерное помутнение, а затем образуя рыхлый хлопьевидный осадок. Они дают весьма характерный рост в желатине; через 24-28 ч (наряду с обильным ростом по ходу укола микробиологической иглы) наблюдают начальное разжижение среды, а на 4-5-е сутки образуется открытая вниз воронка, заполненная разжиженной средой.

Для внутривидовой дифференцировки золотистого стафилококка ( S. aureus ) применяют коагулазный тест (на наличие свёртывающего фактора), положительный у 95% изолятов (рис. 12-3). Существует ещё несколько дифференцирующих признаков.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Питание является одним из важнейших факторов, определяющих здоровье населения. Правильное питание способствует профилактике заболеваний, повышению работоспособности, создает условия для адекватной адаптации к окружающей среде. Одним из важнейших показателей, характеризующих качество и безопасность продовольственного сырья и продуктов питания, является контаминация их микроорганизмами. Учитывая особую значимость продуктов питания в возникновении острых кишечных инфекционных заболеваний и бактериальных пищевых отравлений, уделяется пристальное внимание мониторингу за микробиологической чистотой продовольственного сырья и пищевых продуктов. Ведущее место в санитарно-бактериологических исследованиях является выполнение исследований продовольственного сырья и пищевых продуктов. Стафилококки – одна из ведущих причин микробных пищевых отравлений. Стафилококки вызывают множество инфекций в организме человека, в том числе поверхностные и глубокие гнойные инфекции, интоксикации, инфекции мочевых путей. Важнейшим патогенным стафилококком является Золотистый стафилококк – Staphylococcus aureus – стойкий, высоковирулентный, легко приобретающий устойчивость к антимикробным препаратам возбудитель инфекции. Staphylococcus aureus является одним из важнейших возбудителей инфекций человека и вызывает более 100 нозологических форм заболеваний. Золотистый стафилококк может размножаться в продуктах питания. Чаще всего, в кондитерских изделиях и молочных продуктах, в мясных изделиях (полуфабрикаты и колбасы), в рыбе (слабосоленая, консервы). Сам микроорганизм не представляет угрозы для человека. Он быстро погибает в желудке под воздействием соляной кислоты. Но в процессе жизнедеятельности золотистый стафилококк выделяет энтеротоксин, который накапливается в продуктах питания. Попадая в желудочно-кишечный тракт, этот токсин вызывает симптомы пищевого отравления.

1. Билетова Н.В., Корнелаева Р.П., Кострикина Л.Г. и др. Под ред. Любашенко и С.Я. Санитарная микробиология. - М.: Пищевая промышленность, 2010 г.

2. Корнелаева Р.П., Степаненко П.П., Павлова Е.В., Санитарная микробиология сырья и продуктов животного происхождения. - М.: 2012 г.

4. ГОСТ 31746-2012. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus.

5. Онищенко Г.Г., Абаев И.В., Дятлов И.А., Скрябин Ю.П. и соавт. Молекулярно- генетическая идентификация штамма Staphylococcus aureus — возбудителя пищевой токсикоинфекции при вспышке в Санкт-Петербурге в 2013 г. // Актуальные вопросы микробиологии. – 2014, № 9-10. – С. 33-34.

6. Пруссова В.Н., Кива М.С., Клименко В.В. Микробиологический мониторинг за пищевыми продуктами по обоснованию сроков годности и условий хранения // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2013. №2-3(52). С. 94-97.

7. Пруссова В.Н., Кива М.С. Микробиологический мониторинг за пищевыми продуктами // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2015. №4(62). С. 142-146.

Основными источниками обсеменения стафилококками пищевых продуктов являются люди и животные с гнойно-воспалительными процессами (абсцессы, фурункулы, гнойные раны и др.), а также носители этих микроорганизмов. Перенос стафилококков от людей на пищевые продукты может происходить воздушно-капельным путем, при непосредственном контакте людей с продуктами, оборудованием, в процессе убоя скота и разделки туш.

Чаще всего причиной стафилококковых токсикозов является употребление молока, мяса и мясных изделий, кондитерских изделий с заварным кремом и др., контаминированных патогенными стафилококками. Органолептические свойства продуктов, в которых размножаются стафилококки и накапливаются энтеротоксины, не изменяются [2].

Энтеротоксигенные стафилококки размножаются в пищевых продуктах даже при содержании в них около 40% влаги. Они могут развиваться в продуктах, содержащих от 7% до 12% хлорида натрия. Сахар угнетает развитие стафилококков при концентрациях 30–40%. Некоторые микроорганизмы (В. сеreus, дрожжи из рода Саndidа и др.) оказывают на стафилококки стимулирующий эффект (они усиливают образование энтеротоксина).

Энтеротоксин стафилококков обладает высокой термоустойчивостью. Инактивирование (разрушение) токсина происходит только через 2,5–3 часа кипячения. При автоклавировании (120°С) токсин разрушается через 20 мин. При благоприятных температурных условиях энтеропатогенные стафилококки быстро размножаются в продуктах и продуцируют токсин. Пищевые токсикозы, вызванные энтеропатогенными стафилококками, протекают в форме острого гастроэнтерита, сопровождающегося рвотой, реже диареей, головной болью. Инкубационный период очень короткий – от 30 мин до 6 ч. Длится заболевание один, реже – два, три дня [1].

Выявление и определение количества этих микроорганизмов в пищевых продуктах проводят в соответствии с ГОСТ 31746-2012. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus посевом: в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на (в) агаризованные селективно-диагностические среды [4].

Метод выявления и метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом с предварительным обогащением основаны на высеве навески продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.

При пересеве на агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном выросшие типичные колонии без подтверждения по биохимическим признакам относят к коагулазоположительным стафилококкам.

Определенное количество жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции вносят в жидкую селективную питательную среду [6].

Перед посевом анаэробные условия в среде создают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин, наслоением агара или парафина в каждую пробирку после посева, а также с помощью альтернативной процедуры - инкубирования пробирок в емкости или инкубаторе в анаэробных условиях.

Пробирки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков на Жиолитти-Кантони бульоне определяется по редукции теллурита калия, а на глюкозном или солевом бульоне - по помутнению среды [3].

Поверхность одной из агаризованных селективно-диагностических сред (Байрд-Паркер агара, молочно-солевого, яично-желточно-азидного, яично-желточно-солевого агара, агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном), инокулируют из предположительно положительных пробирок после 24 ч и все оставшееся пробирки после 48 ч.

Чашки Петри с посевами инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по редукции теллурита калия и яично-желточной реакции (лецитиназной активности) [7].

На агаре с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном после инкубирования присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по типичным колониям, показавшим специфичную реакцию (бычий фибриноген/кроличья плазма).

Подтверждение принадлежности типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам проводят по изучению отношения выявленных микроорганизмов к окраске по Граму, определению присутствия у них каталазы и коагулазы.

Подтверждение принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению образования ацетоина, определению ферментации в аэробных условиях мальтозы и, при необходимости, определению термостабильной нуклеазы и гемолитической активности. Результаты выявления коагулазоположительных стафилококков и S. aureus выражают: "обнаружены" или "не обнаружены"[5].

Метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus. Навески продукта и (или) серию разведений навески продукта вносят в жидкую селективную питательную среду. Наиболее вероятное число коагулазоположительных стафилококков и S. aureus в 1 см или в 1 г продукта определяют для подтвержденных посевов, пользуясь НВЧ-таблицей по ГОСТ 26670.

Методы определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на (в) агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве навески продукта и/или разведения навески продукта на (в) агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных и (или) атипичных колоний, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus [4].

Проводят посев определенного количества жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции на (в) агаризованную селективно-диагностическую питательную среду на две параллельные чашки Петри. Аналогично проводят посев десятикратных разведений испытуемого продукта. Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.

При посеве в (на) агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном определяют только типичные колонии и без подтверждения по биохимическим признакам их относят к коагулазоположительным стафилококкам.

При выявлении коагулазоположительных стафилококков в определенной навеске исследуемого продукта или его эквивалентном разведении с предварительным обогащением эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред [6,7].

Перед использованием Жиолитти-Кантони бульон прогревают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин для удаления воздуха. Охлаждают до 44 °С - 47 °С и с соблюдением правил асептики прибавляют раствор теллурита калия.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой нормальной концентрации 1:10. При использовании среды двойной концентрации соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой 1:1 [3].

Если при последующем подтверждении принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus не определяют наличие термостабильной нуклеазы и гемолитической активности, то допускается проводить посев в Жиолитти-Кантони бульон без прогрева перед посевом и без наслаивания голодного агара или парафина после посева.

Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Если появилось почернение или черный осадок в Жиолитти-Кантони бульоне или помутнение в солевом или сахарном бульоне, то проводят подтверждение принадлежности выросших микроорганизмов к коагулазоположительным стафилококкам. Если почернения, черного осадка или помутнения нет, то посевы инкубируют еще (24±2) ч [2].

Для получения изолированных колоний стерильной петлей делают пересевы культур из каждого посева на поверхность чашки Петри с одной из агаризованных селективно-диагностических сред: Байрд-Паркер агара, Байрд-Паркер агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара или яично-желточно-солевого агара. Пересевы проводят также из пробирок, в которых нет видимых признаков роста.

Чашки Петри с пересевами инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч или (48±2) ч. После 24 ч инкубирования чашек Петри по отмечают на дне чашек присутствие типичных и атипичных для коагулазоположительных стафилококков колоний [1].

На Байрд-Паркер агаре после инкубирования в течение 24 ч коагулазоположительные стафилококки образуют типичные колонии черного или серого цвета, блестящие и выпуклые, окруженные прозрачной зоной, диаметр колоний около 1,0-1,5 мм и до 1,5-2,5 мм после инкубирования в течение 48 ч. После инкубирования в течение 24 ч непосредственно около колонии в прозрачной зоне может появиться опалесцирующее кольцо, окружающее колонию.

Принадлежность выявленных коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению их способности образовывать ацетоин и ферментировать мальтозу в аэробных условиях [5].

Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера). Культуру высевают в пробирки со средой Кларка. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. После инкубирования посевов к 1 см отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см раствора - нафтола и 0,2 см раствора гидроокиси калия. Появление розового окрашивания через 15-60 мин указывает на положительную реакцию. S. aureus образует ацетоин.

Определение ферментации мальтозы в аэробных условиях. Способность ферментации мальтозы в аэробных условиях определяют с целью дифференциации S. aureus от других коагулазоположительных видов S. intermedius и S. hyicus. Для определения ферментации мальтозы в аэробных условиях культуры, подлежащие исследованию, высевают уколом петлей в среду Гисса с мальтозой. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. При ферментации мальтозы в аэробных условиях с образованием кислоты цвет среды Гисса изменяется. S. aureus ферментирует мальтозу в аэробных условиях [4].

Оценка результатов посевов в жидкие среды. При определении НВЧ коагулазоположительных стафилококков или S. aureus или при их выявлении в определенной навеске продукта посевы считают положительными (то есть коагулазоположительные стафилококки или S. aureus выявлены в испытуемой навеске продукта), если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждении типичных и (или) атипичных колоний, выросших на этих средах, хотя бы в одной колонии будут обнаружены коагулазоположительные стафилококки или S. aureus [6].

Результаты выявления коагулазоположительных стафилококков или S. aureus записывают: обнаружены (не обнаружены) в 1 г (см3) продукта; масса или объем продукта, в котором выявляли коагулазоположительные стафилококки или S. aureus.

Средства контроля и вспомогательные устройства. Аппаратура, материалы, реактивы по ГОСТ 9225 со следующими дополнениями:

Питательные среды. Гидролизованное и стерильное обезжиренное молоко по ГОСТ 10444.11.

Желточную эмульсию готовят следующим образом. Свежее куриное яйцо моют водопроводной водой, затем протирают ваткой, смоченной в спирте, и обсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см 3 стерильного раствора хлористого натрия по ГОСТ 9225. Тщательно перемешивают. Приготовленная эмульсия может храниться при температуре 0–5 °С не более 72 ч.

Солевой бульон (допускается применение солевого бульона, который готовится согласно указанию на этикетке). Состав: натрий хлористый (NaCl) – 7,5 г; питательный сухой бульон – 1,5 г (или гидролизованное молоко – 100 см 3 ).

Приготовление: в 100 см 3 дистиллированной воды вносят 1,5 г сухого питательного бульона, кипятят 1–2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9 ± 0,1).

Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение(10 ± 1) мин.

Или к 100 см 3 гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9 ± 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.

Желточно-солевой агар [1] . Состав: питательный агар [2] для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г или питательный агар II 8 (на основе гидролизата кормовых дрожжей) 24 г; натрий хлористый (NaCl) – 75 г; эмульсия желточная – 50,0 см 3 ; вода дистиллированная – 1 дм 3 .

Приготовление: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 75 г хлористого натрия (NaCl), кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватный тампон, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации охлаждают до температуры (45 ± 1) °С и добавляют 50 см 3 предварительно подготовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

Молочно-солевой агар [3] . Состав: питательный агар [4] для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г; или питательный агар II 10 (на основе гидролизата кормовых дрожжей) – 24,0 г; натрий хлористый (NaCl) – 75,0 г; молоко обезжиренное – 100 см 3 ; вода дистиллированная – 1 дм 3 .

Приготовление: среду готовят, как указано выше, но после охлаждения до температуры (45 ± 1) °С добавляют вместо желточной эмульсии 100 см 3 стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

Агар Байрд-Паркера. Среда готовится согласно указанию на этикетке. Состав. Основа среды: триптон – 10,0 г; дрожжевой экстракт – 1,0 г; мясной экстракт – 5,0 г; литий хлористый гексагидрат – 5,0 г; агар – 12,0–20,0 г; вода дистиллированная – 1 дм 3 .

Раствор пирувата натрия: пируват натрия – 20,0 г; вода дистиллированная –100 см 3 .

Раствор глицина: глицин – 20,0 г; вода дистиллированная – 100,0 см 3 .

Приготовление основы среды: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара.

При отсутствии мясного экстракта, триптона и дрожжевого экстракта вместо дистиллированной воды применяют 1 дм 3 мясопептонного бульона или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой или питательный агар сухой II.

Все компоненты, внесенные в 1 дм 3 дистиллированной воды (мясопептонный бульон), нагревают и перемешивают до полного растворения, охлаждают до температуры 50–60 °С. Устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают в колбы или бутылки по 90 см 3 и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.

При использовании сухой среды в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 5 г хлористого лития. Нагревают до полного растворения, охлаждают до температуры 50–60 °С, устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают и стерилизуют как указано выше.

Готовую основу среды хранят не более 30 сут при температуре (6 ± 2) °С.

Перед использованием к 90 см 3 расплавленной основы среды добавляют асептически стерилизованные фильтрованием через мембранный фильтр растворы: 6,3 см 3 раствора глицина, 5 см 3 раствора пирувата натрия; 1 см 3 раствора теллурита калия; 5 см 3 желточной эмульсии.

Допускается растворы глицина, пирувата натрия, теллурита калия и желточную эмульсию готовить в асептических условиях на стерильной дистиллированной воде.

После тщательного перемешивания приготовленную среду разливают в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.

Порядок подготовки к проведению контроля. Приготовление растворов и реактивов . Раствор плазмы кроличьей цитратной готовится согласно инструкции по применению плазмы, прилагаемой к упаковке.

Растворы и реактивы для окраски препаратов готовят по ГОСТ 9225.

Приготовление реактивов для окраски по Грaму . Приготовление реактива 1: в 100 см 3 этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового.

Приготовление реактива 2: к 96 см 3 спиртового раствора йодистого калия массовой концентрацией 5 г/дм 3 добавляют 2 см 3 спиртового раствора основного фуксина массовой концентрацией 50 г/дм 3 и 2 см 3 спиртового раствора йода массовой концентрацией 50 г/дм 3 .

Йодистый калий растворяют в спирте на водяной бане при температуре (45 ± 5) °С при постоянном помешивании.

Отбор и подготовка проб по ГОСТ 9225.

Метод определения количества Staphylococcus aureus с предварительным обогащением

Подготовка и проведение контроля. Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений по ГОСТ 9225 так, чтобы можно было определить наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном документе на конкретный продукт.

Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см 3 в пробирки или колбы с солевым бульоном.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведенной питательной средой 1:10.

Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний или на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера, желточно-солевой агар или молочно-солевой агар.

Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48 часов.

После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.

На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2–4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.

На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2–4 мм, слегка выпуклых.

На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1–1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1–3 мм.

С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных колоний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, 1 см желточно-солевого агара, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии.

Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 часов.

У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.

Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus, колоний делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. Затем вносят петлей каплю реактива 1, для окраски по Граму.

Смесь распределяют на участке примерно 1 см 2 , просушивают при температуре (20 ± 2) °С, фиксируют, медленно пронося предметное стекло над пламенем горелки. На одном стекле можно готовить по шесть-восемь мазков, отделяя их один от другого линиями, проведенными с лицевой стороны стекла.

Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2 для окрашивания по Граму так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания 0,5–1 мин. После окрашивания препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат просушивают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму, будут темно-фиолетового цвета, не красящиеся по Граму – красного цвета.

Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.

Постановка реакции плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 см 3 разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, в другую засеивают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительный стафилококк).

Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37 ± 1) °С в течение 3–6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то оставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.

При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).

Реакцию считают положительной, если:

+++ – сгусток, имеющий небольшой отсек;

++ – сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом.

При получении положительной реакции считают, что в посевах обнаружен Staphylococcus aureus.

Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Оформление результатов контроля. Морфологические, культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта.

Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения

После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри (желточно-солевой агар, молочно-солевой агар и агар Байрд-Паркера, см. предыдущий метод). С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и/или подозрительных колоний Staphylococcus aureus, а в случае роста менее пяти – все колонии, характерные для Staphylococcus aureus, и пересевают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки (см. желточно-солевой агар), но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика как в предыдущем методе.

Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Оформление результатов контроля. Количество колоний Staphylococcus aureus в 1 г или 1 см 3 после определения его в определенной навеске продукта вычисляют по формуле:

где Σn₁, Σn₂ – количество колоний, выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянного объема; n – число десятикратных разведений.

Пример. Подсчитываем количество колоний Staphylococcus aureus, выросших на трех засеянных чашках при посевах продукта или его разведений:

1 г или 1 см 3 продукта:	84	96	72
10 -1 разведение:	9	10	7

10 -1 разведение:	84	96	72
10 -2 разведение:	99	10	7

[1] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

[2] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм 3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.

[3] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

[4] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм 3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.

Прошло много лет после написания первой статьи, посвященной лечению инфекций, вызванных золотистым стафилококком. За это время автор, будем надеяться, немного помудрела и приобрела кое-какой опыт в более детальной диагностике вышеупомянутых состояний, чем и хотела бы поделиться с многоуважаемой аудиторией в надежде, что, возможно, поможет каждому из вас в рутинной ежедневной работе, так как с этой зверюшкой сталкивается буквально каждый, кто надел белый халат и уж тем более хирургический костюм.

Автор: Трубачева Е.С., врач – клинический фармаколог

Сначала повторим общеизвестные факты: S.aureus относится к грамположительным коккам и являются чуть ли не основной причиной большого количества инфекций кожи и мягких тканей, а так же ведущей причиной послеоперационных раневых инфекций.

Выделяют следующие разновидности золотистого стафилококка:

Дикий S.aureus
MSSA – метициллин-чувствительные стафилококки
MRSA – метициллин-резистентные, которые обладают устойчивостью ко всему бета-лактамному ряду, сохраняя клинически важную чувствительность к ванкомицину, линезолиду и тигециклину
VRSA и VISA – ванкомицин-устойчивые штаммы, к счастью, крайне редко встречающиеся и в основном наблюдающиеся в отделениях онкогематологии научно-исследовательских центров у пациентов, проходящих курс полихимиотерапии с последующей трансплантацией костного мозга

И сейчас обсудим первые три более подробно, так как именно они являются той причиной, ради которой повторно поднята данная тема, в том числе и по просьбам читателей (за что выражаем отдельную признательность).

Первое, что необходимо не просто запомнить, а буквально зазубрить наизусть – золотистый стафилококк, он же S.aureus, является нормальным жителем на неповрежденной коже и слизистых оболочках. Еще раз – нормальным, но только на неповрежденной коже и вне зависимости от антибиотикочувствительности пойманных экземпляров. Если кожа по тем или иным причинам поражается (например, сахарным диабетом) или повреждается, стафилококк тут же из милого соседа превращается в злейшего врага. Все как у людей – стоит дать слабину, и ближайшие соседи начнут добивать с ласковой улыбкой.

Таким образом, когда вы получаете результат микробиологического исследования образца, взятого с кожи (или из носоглотки), и видите там золотистого стафа, то должны понимать, кто перед вами, и насколько этот кто-то имеет отношение к текущему процессу.

Второе: если клиника отсутствует, а стафилококк посеялся, надо сделать что? Правильно, повторить посев еще раз. Золотистый стафилококк – это один из немногих микробов, чье наличие в отделяемом материале надо проверять дважды. Единственное исключение – это кровь, взятая непосредственно из сосудистого русла, чаще всего из вены. Наличие стафилококка в крови является поводом к немедленному назначению антибактериальной терапии, так как прямо указывает на наличие инфекции кровотока, а уж какого она генеза, спонтанного или ятрогенного, разбираться будете позже. Во всех остальных ситуациях проводится пересев с тщательным соблюдением техники забора материала (со стенок раны, а не гной, состоящий из дохлых нейтрофилов и нападавших сверху стафилококков) и правил асептики и антисептики, чтобы собственными стафилококками с кожи вновь забранный материал не контаминировать.

Чтобы понять, друг перед нами или враг, познакомимся со стафилококками более подробно.

Дикий S.aureus, не видавший ни одного антибиотика, выглядит так

И нет, автор не сошла с ума – резистентность к ванкомицину у природных диких золотистых стафилококков – совершенно нормальное явление. Более того, попытка лечить такого возбудителя ванкомицином считается грубейшей ошибкой и закончится полным провалом в силу природной устойчивости к данному препарату. Это третье, о чем помнить необходимо.

Где мы встречаем таких S.aureus чаще всего? В носоглотках грудных младенцев или в их же кале, если придумали посеять. Почему? Потому что это представитель нормальной микрофлоры кожи, и ребенок сглатывает то, что живет в его носоглотке или слизывает с кожи матери. Надо лечить? В данной ситуации – ни в коем случае, иначе побьете нормальную микрофлору кожи и слизистых, и если очень повезет, то для ребенка это пройдет без последствий, но, скорее всего, получим стафилококка, вооруженного пенициллиназами, или MSSA. Повторимся еще раз – только в случае отсутствия клинической картины можно принимать такого рода решения. Во всех иных случаях необходима антибактериальная терапия, причем на длительный (до 28 суток) период времени.

При каких состояниях мы можем увидеть подобных возбудителей?

Практически при всех инфекциях кожи и мягких тканей
При внутрибольничных раневых инфекциях
При диабетической стопе
У внутривенных наркоманов

Типичным для клинической картины будет довольно агрессивное течение заболевания с яркими клиническими проявлениями ввиду того, что именно такой вид стафилококка обладает определенным набором ферментов, очень быстро расплавляющим окружающие ткани с образованием полостей и большим количеством гнойного отделяемого.

на антибиотикограмме будет выглядеть приблизительно так, оксациллин-резистентный, но ванкомицин-чувствительный (хотя при таком значении МПК уже возможны варианты)

Когда встречается? Все многообразие ятрогенных ВБИ к вашим услугам – почти все раневые инфекции и послеоперационные гнойные осложнения вне зависимости от их локализации. Повторимся в очередной раз – руки надо мыть, и мыть правильно. А еще закрывать маской не только рот, но и нос всем, кто хоть как-то касается открытых ран вне зависимости от причин их образования, так как стоит ране появиться, как стафилококк мгновенно превращается в зверя, осложняющего течение любого послеоперационного периода, особенно после операций, связанных с установками импланта. Более подробно о лечении предлагаем почитать в первой статье.

В последнем пункте автор, по идее, должна была бы предложить испугаться самыми страшными ванкомицин-резистентными стафилококками и предложить схватиться за голову, но глядя на следующий набор антибиотикограмм, мы предлагаем посмотреть на то, что обычно сваливается с рук медицинского персонала в раны пациентов или контаминирует их биологический материал, который собран или хранится неправильно. Слава микробиологии, что подобные возбудители для пациентов, которые сохранили хоть какие-то остатки неспецифического иммунитета, не опасны, так как проходя эволюционные пути борьбы с ванкомицином, они почти полностью теряют факторы вирулентности. Но так как такие находки – это будни любой микробиологической лаборатории, то и вы о них тоже должны иметь представление. Уточним еще раз – это результаты посевов при полном отсутствии клинической картины бактериальной инфекции.

А теперь, тихо-тихо прошепчем, что иногда так может выглядеть приболевший микробиологический анализатор, который все, что в него не поставят, может определять как подобную страшную зверюгу. Хотя у вашего анализатора может быть какая-то своя болячка, и эти болячки лучше все-таки знать. Именно такого рода антибиотикограммы, как ничто другое наглядно показывают необходимость развития клинического мышления для умения отличать истинного возбудителя от контаминанта или нормального жителя человеческого организма, а также необходимости понимания, как работают методы микробиологической диагностики и варианты их ограничения.

Подведем краткие итоги нынешнего разговора:

Стафилококк на неповрежденной коже и в носоглотке является нормальным представителем микромира, и лечить его не надо, более того, это может наносить прямой вред (как минимум кошельку)
Существует целый перечень профессий, где носительство стафилококка строго нежелательно, и именно для этого проводятся контролирующие посевы среди медицинского персонала и работников пищевой отрасли
Необходимо уверенно различать не только дикие и внутрибольничные штаммы, но и градацию по MRSA и MSSA, так как это прямо влияет на решение о применении конкретных препаратов при проведении эрадикационной терапии
Антибиотикотерапия стафилококковых инфекций должна быть длительной, а не прерываться через 7-10 дней, даже если пациент демонстрирует положительную динамику. Недобитые золотистые стафилококки умеют метастазировать. Более подробно смотрим предыдущую статью
Так как S.aureus занимает одно из ведущих мест в структуре внутрибольничных инфекций, особенно связанных с установкой имплантов, правила асептики и антисептики при работе с оными должны соблюдаться максимально жестко, иначе можно повторить дело Хабаровского кардиоцентра

Читайте также: