Посев на элективные среды принцип метода
Добавил пользователь Евгений Кузнецов Обновлено: 19.09.2024
Бактериологический (культуральный) метод — комплекс методов для выявления патогенных микроорганизмов у больного, у носителя или на объектах внешней среды. Это метод выделения, выращивания и определения свойств чистой культуры микроорганизмов с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация. Выделение чистой культуры основа бактериологического метода.
Чистая культура — микроорганизмы одного вида, полученные из одной или нескольких клеток в результате размножения на искусственной питательной среде.
Бактериологическое исследование может быть использовано для диагностики, профилактики инфекционных заболеваний, для санитарно-гигиенической характеристики среды, окружающей человека, для научного исследования.
Материал и метод бактериологического исследования зависят от цели анализа, условий среды, патогенеза и течения заболевания.
В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование. Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:
1-й день (I этап). - Основная цель этого дня – произвести посев исследуемого материала таким способом и методом, чтобы получить рост изолированных колоний.
1. Макроскопическая оценка исследуемого материала (объём, цвет, характер, консистенция). От этой оценки зависит подготовка материала к посеву и выбор сред.
Механический метод выделения чистой культуры используют если:
Материала много и он жидкий (моча, СМЖ), то материал центрифугируют и для посева используют осадок, предварительно слив надосадочную жидкость, таким образом, посевной материал содержит все микроорганизмы исследуемого материала.
Если материал вязкий ( гной, мокрота, фекалии), то небольшую порцию материала растирают со стерильным физ. раствором и полученную эмульсию используют для посева.
Если материал плотный (кусочки ткани или кости), то с них делают смыв стерильным физ. раствором и засевают на среды смывы.
Физический метод используют, если исследуемый материал по направлению предполагает наличие споровых культур, в таком случае часть или весь материал прогревают до + 80 0 С, при этом сопутствующая вегетативная флора погибает, а сохранившиеся споры после посева прорастают и дают чистую культуру возбудителя.
Химический метод используют, если материал может предполагать наличие кислотоустойчивых бактерий, то в этом случае порцию материала обрабатывают 2-4 % раствором H2SO4, а затем нейтрализуют щёлочью под контролем индикатора и используют для посева. При такой обработке погибает вся сопутствующая флора, сохраняются только кислотоустойчивые бактерии. Соответственно поступают и при наличии щёлоче- и спиртоустойчивых бактерий.
Биологический метод. К этому методу относят добавление в питательную среду антибиотика, к которому устойчив предполагаемый возбудитель, этом случае гибнет под воздействием данного антибиотика вся сопутствующая флора в исследуемом материале. Также к биологическому методу относят заражение исследуемым материалом лабораторных животных, чувствительных к данному возбудителю, после чего у животного берут материал и высевают на питательные среды.
Метод элективных сред позволяет выделить определённого возбудителя, за счет нахождения в питательной среде элективного фактора к которому чувствительна сопутствующая флора.
2. В некоторых случаях проводят микроскопию мазка из исследуемого материала, окрашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой и ориентировочного ответа, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева.
3. Если в исследуемом материале заведомо мало выделяемого возбудителя, то такой материал засевают на среды обогащения, в этом случае бактериологическое исследование длиться дольше на один или несколько дней.
4.Затем посев материала на питательные среды для получения изолированных колоний. Среды подбирают также исходя из особенностей предполагаемого возбудителя и характера материала.
Способ посева может быть открытым или закрытым, что зависит от возможности предполагаемого возбудителя находиться в воздухе.
Для того чтобы получить рост изолированных колоний можно использовать методы посева, выполненные с помощью бак. петли, шпателя, стеклянной палочки и ватного тампона :
Шпатели и бак.петля.
А.Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии.
Метод Дригальского.
Б.Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора - метод посева по секторам. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, делая посевную площадку, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.
Посев по секторам с посевной площадкой.
Посев по секторам можно произвести и без посевной площадки. Начав с первого сектора без прокаливания петли произвести посев последовательно во втором, третьем и четвёртом секторах.
Посев по секторам.
В. Можно использовать и другие техники посева. Например, посев бактериологической петлёй штрихами или зигзагообразно по всей поверхности чашки Петри. Для этого исследуемый материал набирают стерильной петлей и втирают в поверхность среды возле края чашки.
После этого петлю стерилизуют в пламени, чтобы уничтожить избыток материала, охлаждают. Следующий этап посева начинают с места, где закончился предыдущий. Петлю кладут горизонтально на поверхность агара, где было сделана посевная площадка, проводят один-два раза по поверхности и делают штрихи по остальной среде. Необходимо пытаться, чтобы штрихи посева длились от края к краю чашки, не повреждали поверхности агара и располагались близко друг к другу. Этим искусственно продлевается линия посева и создаются возможности для получения изолированных колоний.
Посев шпателем и тампоном в чашки Петри. Материал предварительно наносят на поверхность питательной среды возле края чашки петлей или пипеткой. Стерильный шпатель проносят через пламя, охлаждают, касаясь стенки чашки. Осторожными круговыми движениями распределяют материал равномерно по поверхности среды.
5.Засеянные чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат для инкубации на 24 часа при 37 0 С.
2-й день (II этап). Начинают данный этап с изучения культуральных свойств полученных колоний. На основании изучения этих характеристик, выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью изучения морфологических и тинкториальных свойств и проверки однородности микробов в колонии (приготовление мазка, окраска по Граму). Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром с целью накопления чистой культуры. Пробирку инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37° С.
Посев на скошенный агар.
Техника посева в пробирки со скошенной средой: На скошенные среды переносят культуру из другой пробирки или с колоний на чашках. Прокалённой петлёй берут часть необходимой колонии с чашки Петри, чашку закрывают и отставляют. Пробирку держат в левой руке наклонном положении между большим и указательным пальцами так, чтобы поверхность среды можно было наблюдать. Петля - в правой руке. Пробку пробирки вынимают, зажимая их между мизинцем и ладонью. В таком положении она остаётся до конца посева. Край пробирки обжигают, переносят петлю, не прикасаясь к стенкам, в пробирку и делают сплошной штриховой посев. Петлю прокаливают, ставят в штатив, край пробирки прокаливают и закрывают пробкой. Техника посева в конденсационную воду: выбирают свежескошенную среду, содержащую на дне каплю конденсационной жидкости. Исследуемую культуру забирают петлей, открывают пробку, обжигают края пробирки, осторожно, не касаясь среды и стенок, вносят в конденсационную воду петлю с культурой. У выраженных подвижных культур рост с конденсационной воды распространяется на влажную поверхность косяка.
Й день (III этап).
1.Описывают культуральные свойства накопленной чистой культуры.
2.Проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка ( мазок окрашивают по Граму, в мазке должны быть однородные по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам клетки). При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.
3. Идентификация выделенной культуры проводится по:
Среды Гисса дифференциально-диагностические питательные среды для выявления ферментативной активности бактерий. Содержат 1% пептонную воду, 0,5% раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, манит, сахароза и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе NaOH). Среда при рН 7,2-7,4 – бесцветна, при ферментации углеводов приобретает красный цвет. В пробирки со средой помещают поплавок (небольшая трубочка, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при расщеплении углеводов.
Пёстрый ряд Гисса для E.coli.
- чувсвительности к антибиотикам.
Фаготипирование по методу Фишера. Испытуемую культуру засевают на МПА, затем условно делят чашку на квадраты. В каждый квадрат наносят по одной капле различных фагов. После суточной инкубации в термостате отмечают квадраты, в которых отмечается лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется типом лизирующего ее фага.
Чувствительность к фагуустанавливают по наличию лизиса культуры (стерильных пятен)
Фагоидентификация по методу Отто. На чашку с МПА шпателем или петлёй выполняется посев выделенной культуры бактерий. Затем наносят каплю известного бактериофага и, наклонив чашку, дают капле несколько растечься по поверхности питательной среды. Через сутки наблюдают полную задержку роста в месте внесения диагностического фага.
- токсигенности и другим признакам.
4. Посевы инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37° С.
4-й день (I V этап). Учет результатов и выдача ответа
© 2014-2022 — Студопедия.Нет — Информационный студенческий ресурс. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав (0.007)
Под питательными средами
подразумевают различного рода субстраты, приготовляемые для изучения
жизнедеятельности микроорганизмов при определенных условиях, изменяемых по воле
экспериментатора. Микрохимические анализы и опыты искусственной культуры
выяснили потребность бактерий в питательных веществах. Согласно этим указаниям
и составляются питательные среды. Существенным условием при этом является
определенное содержание воды. Сухие органические вещества
не заселяются микробами; соление консервирует мясо, отнимая у него известное
количество воды. Первенствующее значение для жизнедеятельности микроорганизмов
имеет затем реакция питательной среды; для большинства бактерий
она должна быть нейтральной или слабощелочной, рост
холерного вибриона прекращается уже при слабокислой реакции. Вас. erythosporus
и micrococcus aquatilis размножаются даже в дистиллированной, 2 раза
перегнанной воде, удовлетворяясь, очевидно, тем ничтожным количеством
органических веществ, какое содержится и в чистой перегнанной воде, или, быть
может, питаясь за счет азота и углерода атмосферного воздуха. Некоторые
микроорганизмы заимствуют нужный им для питания азот из аммиачных или
азотнокислых соединений, другие безусловно требуют наличности в питательной
среде белковых веществ.
Большинство болезнетворных
микроорганизмов хорошо растут в бульоне, мясопептонной желатине и на агаре; другие,
наоборот, нуждаются в питательной среде (кровяной сыворотке, агаре, смазанном
кровью, и т.п.), по составу своему приближающейся к составу тканей и соков
животного организма.
Некоторые строго паразитные
бактерии совершенно не выращиваются на мертвом субстрате, размножаясь лишь в
организме живого существа и даже иногда определенного животного. До сих пор не
удается культивировать на какой-либо искусственной питательной среде лепрозную
палочку, некоторые слюнные бактерии, спирохету возвратной горячки и др.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Выращивание (культивирование) микроорганизмов используется в лабораторных и производственных условиях для выделения, накопления и сохранения микроорганизмов.
Для культивирования микроорганизмов используют специальные питательные среды, которые должны содержать необходимые питательные вещества и являться оптимальной средой обитания микроорганизмов.
В состав питательной среды обязательно входят 5 основных элементов ( С, Н2, О2, N) и зольные элементы, микроэлементы, количество воды не менее 60%.
Универсальных сред, пригодных в равной степени для всех микроорганизмов, не существует. В закономерности от особенностей обменных процессов (фотосинтез, способы получения энергии) отдельным видам микроорганизмам требуются различные составы питательных веществ.
По составу питательные среды подразделяются на 2 группы:
Естественными
называются среды, которые состоят из натуральных пищевых продуктов (молоко, яйца, мясо). Большинство из них применяют в виде экстратов или настоев. Эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов. Они используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.
Примерами служат мясопептонный бульон, почвенная вытяжка, картофельная среда.
Искусственные среды (синтетические среды) — это среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды удобны для использования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение.
Для разработки синтетических сред необходимо знать потребности микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена веществ.
В большинстве случаев синтетические среды готовят на водопроводной воде и микроэлементы не добавляют.
К ним можно отнести: гидролизат козеина, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт.
По назначению различают элективные и дифференциально-диагностические среды.
Элективные среды обеспечивают развитие одного вида или группы микроорганизмов и непригодны для развития других. Элективные среды применяют главным образом для выделения микроорганизмов из мест их естественного местообитания или для получения накопительных культур.
Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды позволяют достаточно быстро отличить одни виды микроорганизмов от других. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы позволить четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида.
Индикаторные среды применяются в клинической бактериологии, при генетических исследованиях.
По физическому состоянию различают: жидкие, плотные, сыпучие среды.
Жидкие среды
широко применяют для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы.
Плотные среды используют для выделения чистых культур (получение изолированных колоний) для хранения культур, количественного учета микроорганизмов.
Сыпучие среды
применяют в промышленной микробиологии. К ним относятся: отруби, кварцевый песок, разваренное пшено.
Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатину и кремнекислый гель.
Агар-агар — сложный полисахарид, получаемый из морских водорослей. Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не использует его в качестве питательного субстрата. в воде агар-агар образует гели которые плавятся при 1000С, а затвердевает при 400С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать микроорганизмы при любой подходящей для их роста температуре.
Информация о статье
wikiHow работает по принципу вики, а это значит, что многие наши статьи написаны несколькими авторами. При создании этой статьи над ее редактированием и улучшением работали, в том числе анонимно, 18 человек(а).
Категории: Образование и коммуникации
На других языках:
English: Grow Bacteria in a Petri Dish, Español: cultivar bacterias en una placa de Petri, Italiano: Coltivare Batteri su un Piatto di Petri, 中文: 在培养皿中养细菌, Français: faire croître des bactéries dans une boîte de Petri, Deutsch: Bakterien in einer Petrischale züchten, Português: Cultivar Bactéria em uma Placa de Petri, Bahasa Indonesia: Menumbuhkan Bakteri Dalam Cawan Petri, العربية: تربية البكتيريا في طبق بتري, Nederlands: Bacteriën kweken in een petrischaal
Эту страницу просматривали 103 715 раз.
Была ли эта статья полезной?
Типы питательных сред
Питательные среды бывают жидкие
и твердые
Главное преимущество жидких сред
заключается в возможно равномерном распределении в них зародышей; этим дается
возможность всегда работать с точно отмеренным количеством бактерий, что
особенно важно при опытах с впрыскиванием последних животным для изучения силы
болезнетворного действия микрофитов. Разводка микроорганизма в жидкой среде,
введенная в полое предметное стекло, дает нам возможность изучить
непосредственно под микроскопом рост и деление клеток, образование микрофитом
различных сочетаний, появление в нем спор и их прорастание
Бульонные культуры
патогенных бактерий, освобожденные соответственной фильтрацией от живых
зародышей, представляют чистые растворы продуктов вещественного обмена
микроорганизмов, различного рода бактерийные яды (токсины), знакомство с
которыми имеет первенствующее значение для уразумения сущности заразных
болезней. Разводки в молоке, пептонной воде и др. дают нам ценные указания для
биологической характеристики многих микроорганизмов, для отличия их друг от
друга. Жидкими средами можно пользоваться, однако, лишь тогда, когда в
распоряжении имеется уже чистая разводка того или другого микроорганизма; разъединение
же зародышей, вылавливание одного из них из той смеси различнейших видов
бактерий, которая встречается в окружающей нас природе, возможно лишь при
помощи плотного субстрата, консистенция которого препятствует смешиванию между
собой различных микроорганизмов, растущих здесь совершенно особняком и на
надлежащем друг от друга расстоянии. Неожиданно быстрое развитие, достигнутое
бактериологией в последние 10 — 15 лет, главным образом обязано введению Р. Кохом
в бактериологическую технику твердых прозрачных субстратов. Питательные среды
до посева исследуемого микроорганизма должны быть тщательно обеспложены, с
целью устранения случайно поселившихся в них посторонних бактерий.
Подготовка питательной среды
Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники органического углерода (субстраты) . Разнообразие таких источников очень велико, так как микроорганизмы потребляют широкий спектр органических соединений, начиная от простейших углеродных соединений, таких как метан (СН4), метанол (СНзОН) и углекислота (CCh), и кончая природными биополимерами.
Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста нуждаются в источниках азота, фосфора, макро — и микроэлементов (калии, магнии. цинке, железе, меди, молибдене, марганце и др). Как правило, эти компоненты заранее вносятся в питательные среды в виде минеральных солей перед началом ферментации. Исключение составляют газообразные компоненты.
Отделение приготовления питательной среды представляет собой цех, оборудованный емкостями для хранения жидких и твердых веществ, средствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройствами для приготовления растворов, суспензий и эмульсий. При этом все компоненты питательной среды хранятся обычно в твердом виде, а приготовление их смеси в заданном соотношении производится в аппарате с мешалкой, куда они непосредственно поступают для последующего растворения. Иногда сначала в отдельных емкостях готовятся растворы каждого компонента, а потом производится их окончательное смешение.
Важнейшим элементом подготовки питательных сред является их стерилизация, поскольку выращивание промышленного микроорганизма должно проводиться, по крайней мере, в начальной стадии, в отсутствие посторонней микрофлоры. Это достигается путем предварительной стерилизации всех потоков, поступающих на стадию ферментации.
Для стерилизации газовых потоков используют фильтрацию через специальные волокнистые фильтры с определенным диаметром пор, которые задерживают клетки микроорганизмов из окружающей среды.
Все потоки могут стерилизоваться термическим, радиационным, фильтрационным или химическим методами.
Наиболее часто в промышленности используется термический метод. Он основан на губительном действии на живые клетки высоких температур. Основным недостатком термической стерилизации являются неизбежные потери питательных свойств среды. Наиболее часто в качестве источника углерода используются углеводы, которые не выдерживают нагревания до высоких температур (120-150°С). Поэтому обычно источники углерода стерилизуют отдельно от растворов минеральных солей, обладающих большей термической устойчивостью.
Некоторые субстраты сами обладают способностью подавлять рост посторонних микроорганизмов, поэтому их стерилизации не требуется. К ним относятся, например, метанол, этанол, уксусная кислота и их концентрированные растворы.
Остальные методы стерилизации применяются реже. Радиационный метод, основанный на облучении материалов большими дозами ионизирующих излучений (гамма-излучение), дает хорошие результаты. Однако он предполагает наличие мощных источников гамма-излучения. Поэтому радиационный метод используют для стерилизации небольших объектов, главным образом медицинского назначения (например, хирургический инструмент, перевязочный материал).
Химический метод
стерилизации основан на использовании веществ, обладающих дезинфицирующим действием. Основной проблемой в этом случае является необходимость удаления стерилизующего агента из питательной среды после подавления посторонней микрофлоры. Это может быть достигнуто путем его химического разложения с образованием нетоксичных для производственной культуры продуктов. К сожалению, число таких веществ очень невелико.
Фильтрационный метод
основан на пропускании питательной среды через специальные фильтры или мембраны, способные задерживать клетки микроорганизмов. Он наиболее пригоден для стерилизации питательных сред, которые не выдерживают действия высоких температур (молоко, растворы белков и др.). Основная трудность, возникающая при использовании этого метода, — необходимость стерилизации самого фильтрующего элемента, который не отличается достаточной термостойкостью.
Непрозрачные питательные среды
Из непрозрачных
питательных сред первое место занимает картофель. Он служит
прекрасным субстратом для многих сапрофитов и патогенных бактерий,
обнаруживающих на нем характерный типический рост; им пользуются также для сохранения
разводок на продолжительный срок и для обнаружения микроорганизмом
спорообразования. Крупные, так называемые салатные картофелины очищаются под
струей воды от грязи, после чего кончиком картофельного ножа вырезают все
подозрительные места (глазки), разрезают картофель на круглые пластинки, кладут
их в маленькие двойные чашки и обеспложивают в коховском аппарате. Рациональнее
еще пользоваться для разводок на картофеле широкими, в 2,5 см в диаметре,
пробирками. Пробочным сверлом вырезают из крупного картофеля цилиндр, разрезают
его по диагонали на два клина и вкладывают каждый из них в пробирку широким
концом вниз. Для предохранения разводки от загрязнения конденсационной водой,
выделяющейся из картофеля, практично пользоваться пробирками, имеющими недалеко
от дна кольцеобразное сужение, на котором и покоится картофельный клин, вода же
собирается на дно пробирки, ниже сужения. Перед опусканием картофеля в пробирку
наливают в последнюю несколько капель воды для предохранения субстрата от
высыхания.
Для пигментных бактерий
пользуются, по Сойка и Кралю, питательной средой, приготовленной из разваренного
в молоке риса: 100 г рисовой муки, тщательно растертой в ступке с 250
куб. см снятого молока, разваривают при постоянном помешивании в густую кашу и
туго набивают последней цилиндрическую трубку. По охлаждении выдавливают
рисовый цилиндр из трубки, разрезают его на несколько параллельных дисков,
укладывают каждый из них в отдельную чашку, куда наливают еще несколько капель
молока, и обеспложивают в течение 1/2 часа в коховском
аппарате. На ярком фоне этой среды разноцветные пигментные бактерии выступают
очень резко.
Хлебная мезга,
обладая кислой реакцией, служит хорошей средой для плесневых грибов. Насыпают в
эрленмейеровские колбы обыкновенный черный хлеб, высушенный и растертый в
мелкий порошок, прибавляют воды до получения однообразной влажной каши и
обезвоживают в паровом котле.
Читайте также: