Метод прямого посева лекарственных средств

Обновлено: 08.07.2024

Испытание на стерильность проводят в асептических условиях, чтобы избежать микробной контаминации образца во время посева.

Для исследования используют следующие питательные среды: тиогликолевую и соевоказеиновый бульон — для культивирования аэробных и анаэробных бактерий и жидкую среду Сабуро—для выявления грибов. Все посевы инкубируют не менее 14 сут. на тиогликолевой среде при температуре 32,5(±2,5)°С, на соевоказеиновом бульоне и среде Сабуро—при температуре 22,5(±2,5)°С. Посевы просматривают ежедневно.

Для определения стерильности используют метод прямого посева и метод мембранной фильтрации. При прямом посеве образцы исследуемого препарата вносят непосредственно в питательные среды, объем которых должен в 10 раз превышать объем вносимого препарата. В случае помутнения питательной среды после внесения образца по окончании инкубации делают пересев на аналогичную среду, удлиняя срок выдерживания посевов на 4 сут.

При испытании мазей и масел образец препарата приготавливают в виде эмульсии, используют фосфатный буферный раствор с твином-80 и стеклянные бусы, а в случае необходимости — нагревание до температуры, не превышающей 42 °С.

При определении стерильности лекарственных средств, обладающих выраженным антимикробным действием, и лекарственных средств в сосудах вместимостью более 100 мл преимущественно используют метод мембранной фильтрации. Исключение составляют препараты антимикробного действия, нерастворимые в воде или изопропилмиристате.

Испытание проводят с использованием фильтрационной установки, которая должна быть смонтирована таким образом, чтобы исследуемый раствор (жидкость) можно было ввести и профильтровать в условиях асептики. После окончания фильтрации мембрану асептически переносят в питательную среду.

Фильтры из нитратцеллюлозы используют для водных, масляных и слабых спиртовых (менее 30%) растворов, фильтры из ацетатцеллюлозы—для концентрированных спиртовых растворов и др. Гидрофобный край фильтра и низкая сорбционная способность сводят к минимуму потери препарата при фильтрации. Для препаратов, не обладающих бактериостатическим или фунгистатическим действием, можно использовать фильтры без гидрофобного края, увлажняя их перед фильтрацией, если нет других указаний. Установки и фильтры стерилизуют автоклавированием.

Если препарат представляет собой раствор в масле, фильтр и установка перед употреблением должны быть тщательно высушены.

Лекарственные средства для инъекций, глазные капли, мази, плёнки, другие лекарственные средства, в отношении которых имеются соответствующие указания в нормативно - технической документации (НТД), должны быть стерильными.

Отбор образцов для анализа - число образцов из каждой серии от 3 до 40, в зависимости от метода стерилизации, для автоклавированных средств - 10. Для исследования лекарственные средства должны быть приготовлены в виде растворов, суспензий или эмульсий.

Определение антимикробного действия лекарственного средства. Во избежание неправильной оценки результатов анализа необходимо определить однократно для каждого наименования лекарственного средства, обладает ли оно антимикробным действием.

Для определения антимикробного действия из ампулы с лекарственным средством следует внести по 1 мл в 3 пробирки с 10 мл тиогликолевой среды и в 1 пробирку с 10 мл жидкой соево-казеиновой среды или среды Сабуро. Для контроля в 3 пробирки с тиогликолевой средой и в пробирку с 10 мл жидкой соево-казеиновой среды или среды Сабуро вносится по 1 мл стерильной дистиллированной воды.

Затем во все пробирки следует внести по 0.1 мл микробной взвеси тест - штамма, содержащего 1000 клеток в 1 мл. В пробирки с тиогликолевой средой вносятся штаммы Staphylococcus aureus; Bacillus subtilis; Escherichia coli; в пробирки с соево-казеиновой средой или средой Сабуро - Candida albicans

Определение антимикробного действия лекарственных средств

Пробирки с тиогликолевой средой

Пробирки с соево-казеиновой средой или Сабуро

Посевы в тиогликолевой среде инкубируют при 30-35°С в течение 2 суток, а на соево-казеиновой среде или среде Сабуро - при 20-25°С в течение 3 суток.

При отсутствии антимикробного действия лекарственного средства в опытных и контрольных пробирках должен наблюдаться рост перечисленных тест - микробов.

В этом случае можно продолжать исследование и провести прямой посев данного лекарственного средства на стерильность.

При наличии антимикробного действия устраняют его. Для этого используют:

1. Соответствующие инактиваторы, указанные в частных фармакопейных статьях (например, пара-аминобензойная кислота для сульфаниламидов, пенициллиназа - для пенициллинов и цефалоспоринов).

2. При отсутствии соответствующего инактиватора препарат при посеве разводят, увеличивая объём питательной среды до 250 мл.

3. Если при этом сохраняется антимикробное действие лекарственного средства, для посева используют метод мембранной фильтрации.

Посев лекарственных средств на стерильность (метод прямого посева). Испытуемый препарат, если необходимо, растворяют в соответствующем растворителе и высевают в количествах, указанных в таблице.

Количество испытуемого препарата для посева в зависимости от объёма содержимого единицу (ампул, флаконов), составляющих серию.

Объём содержимого одной единицы, мл

Объём лекарственного средства для посева, мл

Объём питательной среды

в 10 раз больше

* - Если объём содержимого единицы превышает 100 мл, предпочтительнее использовать метод мембранной фильтрации.

Посевы с тиогликолевой средой инкубируют при температуре от 30 до 35°С, а в соево-казеиновой среде или среде Сабуро - от 20 до 25°0С. Продолжительность инкубации посевов в обеих питательных средах составляет 14 суток. Если во всех посевах роста нет, лекарственный препарат стерилен.

Метод мембранной фильтрации. При определении стерильности лекарственных средств, обладающих антимикробным действием, и лекарственных средств, разлитых в ёмкости больше 100 мл, используют метод мембранной фильтрации. Лекарственное средство фильтруют в асептических условиях через 2 мембранных фильтра, затем смывают 3-4 порциями по 100 мл физ. раствора. Каждую мембрану стерильными ножницами разрезают пополам, половину помещают в тиогликолевую среду, половину - в жидкую соево-казеиновую среду или среду Сабуро.

Посевы выдерживают в термостате при тех же температурах в течение 7 суток при ежедневном просмотре. Для контроля полноты смывания другую мембрану разрезают пополам, и по половине мембраны помещают в питательные среды, куда засевают тест - микробы:

Staphylococcus aureus и Candida albicans. Наличие роста этих микробов после инкубации в термостате указывает на полноту смывания. Для контроля стерильности условий фильтрования производят фильтрование растворителя, и фильтры засевают в те же питательные среды.

Испытание на пирогенность проводится путём введения воды или лекарственного средства кроликам с измерением ректальной температуры. При этом строго соблюдаются условия, исключающие возможность повышения температуры тела кроликов от случайных причин.

Вода для инъекций или раствор лекарственного средства считается пирогенным, если повышение температуры тела кроликов превышает предельные показатели, указанные в фармакопее.

В соответствии с рекомендациями Международной федерации фармацевтов и Государственной Фармакопеи стерильными должны быть следующие лекарственные препараты:

• лекарственные средства для парентерального применения (инъекций, инфузий и др. способов введения);

• глазные лекарственные средства (капли, мази, пленки и др.);

• лекарственные средства для новорожденных;

• субстанции и вспомогательные вещества, используемые при получении стерильных лекарственных средств, которые не подвергаются стерилизации в процессе производства;

• лекарственные средства для введения в полость тела, где в нормальном состоянии отсутствует микрофлора.

При изготовлении инъекционных растворов необходимо соблюдать особые условия. В частности, инъекционные растворы перед стерилизацией должны содержать не более 30 микробных клеток в 1 мл, а время от момента их изготовления до стерилизации не должно превышать 17 часов. Предназначенная для изготовления стерильных лекарственных форм дистиллированная вода до стерилизации не должна содержать кишечной палочки, а общее количество микроорганизмов не должно превышать 10—15 клеток в 1 мл.

Стерильность лекарственных средств достигается совокупностью противомикробных мероприятий на всех этапах их изготовления, хранения и использования.

Стерильность готовых лекарственных средств, а также субстанций и вспомогательных веществ, используемых при их изготовлении, проверяется методом прямого посева или методом мембранной фильтрации с использованием жидкой тиогликолевой (меркаптоуксусной) среды для выделения бактерий и жидкой среды Сабуро для обнаружения грибов.

Определение стерильности лекарственных средств, субстанций, вспомогательных веществ методом прямого посева.Лекарственное средство в виде раствора вносят в стерильные колбы (пробирки) со средами в соотношении 1:10 , с учетом объема препарата. При объеме менее 1 мл высевают весь объем; 1-4 мл — 1 мл, 5-19 мл — 2 мл; 20-100 мл — 2-4 мл; более 100 мл — 10 мл.

Выполняются контроли на нейтрализацию возможного антимикробного действия либо введением соответствующего инактиватора, либо разведением препарата (см. вышеописанные способы устранения антимикробного действия). Дополнительно ставят контроль роста тест-штаммов без препарата путем добавления в среды по 0,1 мл взвеси суточных тест-штаммов S. aureus, E. coli, В. subtilis, С. albicans (посевная доза 1000 бактерий).

Посевы инкубируют 14 дней в тиогликолевой среде при температуре 37 0 С, в среде Сабуро - при 24 0 С. Лекарственное средство считается стерильным если после 14-дневного выращивания в опытных колбах (пробирках) нет признаков роста микроорганизмов (помутнение, пленка, осадок, другие макроскопические изменения), а в контрольных есть. При наличии признаков роста готовят мазок, окрашивают его по Граму, подтверждая при микроскопии наличие микроорганизмов в исследуемых образцах и свидетельствуя о нестерильности препарата.

Определение стерильности химико-фармацевтических препаратов, не обладающих бактериостатическим действием.

Препарат засевают по 0,5 мл в 5 пробирок сМПБ с глюкозой, по 0,2 мл в 3 пробирки с МПА, для выявления анаэробов - по 0,5 мл в 3 пробирки со средой Кита- Тароцци и для выявления плесневых и дрожжевых грибов - по 0,5 мл в 3 пробирки со средой Сабуро. Засеянные среды выдерживают в термостате: при 37°С - 3 пробирки глюкозого МПБ с, 3 пробирки с МПА, 3 пробирки со средой Китта-Тароцци; при 24 0 С -2 пробирки с глюкозным МПБ, 3 пробирки со средой Сабуро. Посевы выдерживают 7- сут при ежедневном просмотре. При проросте сред опыт повторяется из удвоенного количества образцов на двойном количестве сред.

Масляные препараты перед посевом эмульгируют в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия с бусами (в колбу помещают 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 2—3 бусинки). Препарат вносят стерильно в количестве 1 мл и встряхивают 3—5 мин, а затем высевают на питательные среды.

Определение стерильности препаратов, обладающих бактериостатическим действием. Препарат засевают по 5 мл в колбы с 200 мл глюкозного МПБ, инкубируют в течение 3 суток при 37 0 С. Затем делают высевы также, как и при проверке стерильности препаратов, не обладающих бактериостатическим действием.

Определение стерильности препаратов, обладающих бактерицидным действием.

Используется метод мембранной фильтрации, более надежный и экономичный по сравнению с методом посевов. Раствор препарата пропускают через 2 мембранных фильтра, по 10 мл через каждый фильтр. После фильтрации фильтры отмывают от препарата тремя порциями стерильного изотонического раствора хлорида натрия по 100 мл. Фильтры помещают в чашки Петри для определения бактерий — на МПА или тиогликолевую среду, а для определения плесневых и дрожжевых грибов — на среду Сабуро. Наблюдение за посевом ведут в течение 7 сут. На фильтрах не должно вырасти никаких колоний микроорганизмов. В случае пророста опыт повторяют из удвоенного количества образцов и на двойном количестве сред.

Глава 21 ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРЕВЯЗОЧНОГО, ХИРУРГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА, ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ

В микробиологическую лабораторию для исследования на стерильность поступает перевязочный материал (бинты, марлевые салфетки, ватные шарики, тампоны), шовный хирургический материал (шелк, кетгут и др.), простерилизованный в лечебно-профилактических учреждениях. Материал для исследования направляют в лабораторию в день его стерилизации, в закрытых и опечатанных биксах. Пробы кетгута и шелка берет хирургическая сестра в условиях чистой операционной по одному мотку из каждой банки с подготовленным для операции шовным материалом.

Для проведения посевов в боксе необходимы:

  • набор стерильных инструментов – ножницы, корнцанги, анатомические пинцеты;
  • стерильный гипосульфит, 10 % раствор;
  • дистиллированная стерильная вода;
  • набор питательных сред.

Посев исследуемого материала производят:

  • в мясопептонный бульон с 0,5 % глюкозы для выделения аэробной микрофлоры;
  • в среду Китта–Тароцци с 0,15 % агара для выделения анаэ­робных микроорганизмов.

Исследуемый хирургический материал берут из разных мест бикса стерильным пинцетом над пламенем горелки и опускают в 2 пробирки с сахарным бульоном и в 2 пробирки со средой Китта–Тароцци.

Кетгут обычно сохраняют в спиртовом растворе йода, по­этому перед посевом на стерильность необходимо йод нейтра­лизовать. Для этого:

а) моток кетгута помещают на 24 ч в колбу с 30 мл стерильного 10 % раствора гипосульфита;

б) по истечении указанного времени кетгут из раствора гипосульфита переносят в колбу с 30 мл стерильной дистиллированной воды на 24 ч;

в) непосредственно перед посевом моток кетгута извлекают стерильным пинцетом из колбы с дистиллированной водой, кладут в чашку Петри, простерилизованную вместе с кружком фильтровальной бумаги, разрезают стерильными ножницами на куски длиной 2–4 см.

В 2 пробирки с сахарным бульоном и в 2 пробирки со средой Китта–Тароцци (рецепт 161) вносят по нескольку ку­сочков исследуемого кетгута.

СРЕДСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ДЛЯ ВЕТЕРИНАРНОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Методы контроля стерильности

Medicine remedies biological for veterinary use. Methods of sterility control*

Дата введения 2014-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 марта 2013 г. N 55-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по
МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2013 г. N 319-ст введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 года.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

Изменение N 1 внесено изготовителем базы данных по тексту ИУС N 7, 2021

ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 12, 2021 год

Поправка внесена изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на биологические лекарственные средства для ветеринарного применения (далее - лекарственные средства), содержащие инактивированные микроорганизмы, и устанавливает метод бактериологического контроля стерильности.

Для лекарственных средств, содержащих живые микроорганизмы, настоящий стандарт применяют для определения контаминации посторонними бактериями, грибами и микоплазмами.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-2017 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 83-79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия

ГОСТ 2263-79* Натр едкий технический. Технические условия

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 55064-2012.

ГОСТ 2493-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия

ГОСТ 3164-78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия

ГОСТ 3760-79 Реактивы. Аммиак водный. Технические условия

ГОСТ 4159-79 Реактивы. Йод. Технические условия

ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4232-74 Реактивы. Калий йодистый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4234-77 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4523-77 Реактивы. Магний сернокислый 7-водный. Технические условия

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9871-75 Термометры стеклянные ртутные электроконтактные и терморегуляторы. Технические условия

ГОСТ ISO 11133-2016 Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред

ГОСТ 11773-76 Реактивы. Натрий фосфорно-кислый двузамещенный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 18300-87* Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 20730-75 Питательные среды. Бульон мясо-пептонный (для ветеринарных целей). Технические условия

ГОСТ 24104-2001** Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29112-91 Среды питательные плотные (для ветеринарных целей). Общие технические условия

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

3 Условия выполнения испытаний и требования безопасности

3.1 Условия выполнения испытаний

3.1.1 Общие требования проведения микробиологического анализа и работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности - по ГОСТ ISO 7218.

3.1.2 Испытание на стерильность проводят в асептических условиях, чтобы избежать микробной контаминации во время посева, используя ламинар-бокс, бокс или помещение чистое класса "А".

3.1.3 Требования к персоналу - по ГОСТ ISO 7218 и [1]*.

* См. раздел Библиография. - Примечание изготовителя базы данных.

К проведению испытаний допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности, изучившие методики микробиологических работ.

Читайте также: