Интервал между приготовлением навеска продукта их разведений и посева в питательной среде
Добавил пользователь Алексей Ф. Обновлено: 19.09.2024
Вязкие продукты удаляют с поверхности пипетки стерильным тампоном.
Навеску продукта переносят в посуду с пептонно-солевым раствором для приготовления исходного разведения так, чтобы при этом пипетка не касалась поверхности пептонно-солевого раствора. Другой стерильной пипеткой тщательно перемешивают продукт с пептонно-солевым раствором путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.
При работе с вязкими продуктами целесообразно для более быстрого их перемешивания с пептонно-солевым раствором поместить в посуду несколько стеклянных шариков.
2.6.8. Жидкий продукт, насыщенный углекислым газом (СО), переносят в стерильную, закрытую ватной пробкой коническую колбу или в другую посуду и подогревают при частом перемешивании круговыми движениями на водяной бане при температуре от 30 до 37 °С до тех пор, пока из него не перестанут выделяться пузырьки газа.
Навеску от пробы продукта отбирают и обрабатывают по п.2.6.7.
2.6.9. Навеску от проб порошкообразных или сыпучих продуктов отбирают стерильной ложкой или шпателем из разных мест продукта (в случае необходимости, до отбора навески стерильной ложкой удаляют 2 см верхнего слоя продукта), затем навеску переносят в предварительно взвешенную стерильную посуду с крышкой, взвешивают. К навеске добавляют пептонно-солевой раствор в количестве, необходимом для приготовления исходного разведения. Смесь перемешивают или взбалтывают 25-кратным круговым движением с радиусом 30 см до получения однородной консистенции продукта.
Если порошкообразный продукт не растворим в воде, то после его перемешивания с пептонно-солевым раствором полученную суспензию отстаивают в течение 10 мин и вновь сильно встряхивают в течение 1 мин.
2.6.10. Навеску от проб набухающих в воде продуктов отбирают и готовят исходное разведение в соответствии с требованиями нормативно-технической документации на конкретный вид продукта.
2.6.11. Навеску от проб твердых растворимых в воде продуктов отбирают шпателем или ложкой, после их размельчения, размалывания или растирания в асептических условиях и далее обрабатывают по п.2.6.9.
Навеску от проб не растворимых в воде твердых продуктов гомогенизируют в случаях, указанных в нормативно-технической документации. При гомогенизации продукта общее число оборотов гомогенизатора должно составлять 15-20 тыс. Число оборотов гомогенизатора не должно быть менее 8000 и более 45000 оборотов в минуту.
Если при гомогенизации продукта получена неоднородная масса, то ее отстаивают в течение 15 мин и для посева и (или) приготовления разведений используют надосадочную жидкость.
Допускается гомогенизацию нестерилизованного продукта проводить путем растирания его до достижения однородной консистенции в стерильной ступке с соблюдением условий асептики.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
2.6.12. Навеску от проб пастообразных продуктов отбирают после их тщательного перемешивания ложкой или стеклянной палочкой и далее обрабатывают по п.2.6.9.
2.6.13. Навеску от проб жидких жиров отбирают теплой пипеткой, нагретой фламбированием. После заполнения пипетки продуктом остатки его удаляют с поверхности пипетки стерильным тампоном.
Продукт из пипетки вносят в посуду с притертой стеклянной пробкой и разводят требуемым количеством пептонно-солевого раствора, подогретого до 40-45 °С; при выявлении психрофильных микроорганизмов температура не должна превышать 37 °С. Остатки жира, прилипшие к пипетке, ополаскивают пептонно-солевым раствором, который несколько раз насасывают и выпускают из пипетки.
2.6.14. Навеску от проб твердых жиров отбирают после разрезания продукта ножом или проволокой на несколько частей. В случае необходимости удаляют верхний слой.
Навеску продукта отбирают с поверхности срезов из разных мест скальпелем и переносят во взвешенную посуду с крышкой.
Определенную массу навески переносят в широкогорлую посуду с притертой стеклянной пробкой. Остатки жира, прилипшие к стенкам посуды, ополаскивают в той же посуде определенным количеством подогретого до 40-45 °С пептонно-солевого раствора, который доливают в посуду в количестве, необходимом для получения исходного разведения.
От твердых жиров навеску можно отбирать по объему. Жиры растапливают в посуде с широким горлышком на водяной бане при температуре не выше 45 °С; при выявлении психрофильных микроорганизмов температура не должна превышать 37 °С.
После перемешивания растопленного жира его переносят теплой пипеткой в посуду с широким горлышком с притертой стеклянной крышкой, содержащую необходимое количество пептонно-солевого раствора для приготовления исходного разведения. Пептонно-солевой раствор предварительно подогревают до 40-45 °С; при выявлении психрофильных микроорганизмов до 37 °С.
2.6.15. Навески от проб взбитых продуктов или кашицеобразной консистенции, содержащих большое количество жиров, после перемешивания стеклянной палочкой отбирают ложкой во взвешенную посуду и добавляют пептонно-солевой раствор, подогретый до 40-45 °С, в количестве, необходимом для приготовления исходного разведения.
2.6.16. Определение микробного загрязнения поверхности проб продукта проводят смывом с помощью ватных тампонов.
Стерильный ватный тампон смачивают пептонно-солевым раствором и протирают им в разных местах поверхность различных кусков анализируемого продукта общей площадью 100 см.
Площадь анализируемой поверхности измеряют при помощи стерильных шаблонов с отверстиями надлежащего размера.
Тампон помещают в пробирку, содержащую 10 см пептонно-солевого раствора. Содержимое пробирки тщательно перемешивают при помощи пипетки. Полученную суспензию считают исходным разведением.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
2.7. Подготовка десятикратных разведений
2.7.1. Первое десятикратное разведение навески является исходным, исходное разведение готовят в соответствии с п.2.6. Из него получают последующие разведения.
2.7.2. Последующее второе разведение готовят из одной доли исходного разведения и девяти долей пептонно-солевого раствора путем смешивания в пробирке.
Если для перемешивания исходного разведения применяли пипетку, то этой же пипеткой вносят 1 см исходного разведения в 9 см пептонно-солевого раствора, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешивают другой пипеткой путем десятикратного насасывания и выдувания из него содержимого пробирки.
2.7.3. Третье и последующие разведения готовят аналогичным способом.
2.7.4. Интервал между приготовлением навесок продукта, их разведений и посева в питательные среды не должен превышать 30 мин.
1. При подсчете микроорганизмов, культуральные среды (разбавители) или их разведения, разливают в количествах, превышающих 9 мл. Вместимость пробирок, колб или флаконов должна быть соответственно указана.
2. Жидкую испытуемую пробу встряхивают в руке, производя 25 движений вверх и вниз с амплитудой около 30 см за 7 с. Пипеткой отбирают 1мл исследуемой пробы и вносят его в 9 мл разбавителя, избегая контакта пипетки с разбавителем. Осторожно смешивают исследуемую порцию с разбавителем путем десятикратного втягивания другой пипеткой или в механическом смесителе в течение 5-10 с. Частоту вращения смесителя надо подбирать так, чтобы жидкость, которая образует воронку, не доходила до края сосуда на 2-3 см. Конкретный способ смешивания указан в стандарте, касающемся изучаемого продукта.
3. Другие продукты. Взвешивают навеску испытуемой пробы массой (10±0,01) г или массой, кратной 10 г в резервуаре вращательного встряхивателя или в пластиковой емкости, достаточной для выполнения исследования и приготовления всех дальнейших разведений, требуемых специальным стандартом для исследуемого продукта.
Добавляют объем разбавителя, равный 9 мл или кратный 9 мл. Вращательный встряхиватель используют в течение времени, достаточного для того, чтобы получить от 15000 до 20000 оборотов, но не более 2,5 мин.
4. Дальнейшие десятикратные разведения.В случае исследования на наличие или отсутствие микроорганизмов в 0,1 мл или 0,1 г продукта готовят следующие разведения.
Переносят чистой пипеткой (если смесь исходной суспензии была получена пипеткой, используют ту же пипетку) 1 мл исходной суспензии (первичное 1+9 (10 -1 ) разведение в другую пробирку, содержащую 9 мл стерильного разбавителя, избегая контакта пипетки с разбавителем.
Тщательно перемешивают или путем десятикратного втягивания чистой пипеткой, или в механическом смесителе в течение 5-10 с, чтобы получить разведение 10 -2 . Частоту вращения смесителя подбирают так, чтобы жидкость во время образования воронки не доходила до краев сосуда на 2-3 см. При необходимости повторяют эти операции, т.д. до тех пор, пока не будет получено приемлемое число микроорганизмов (рисунок 1).
§ 5
ПОДСЧЕТ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
1. Чашка Петри должна быть маркирована этикеткой, на которой указывают номер образца, разведение, дату посева и другую необходимую информацию.
2. Необходимо выбрать определенные разведения, чтобы обеспечить получение определенного количества колоний на чашках и преодолеть возможные ингибирующие свойства.
Для переноса каждого разведения используют отдельную стерильную пипетку, кроме случаев, когда работу ведут от самого высокого разведения к самым низким разведениям.
3. Количество чашек Петри на каждое разведение.В микробиологии пищевых продуктов обычно используют одну чашку на каждое разведение микроорганизмов согласно требованиям ISO/IEC 17025. В других случаях следует использовать две чашки для каждого разведения в соответствии с ISO 8199
.§ 7
МЕТОДЫ ПОСЕВА В ЧАШКИ
Посев в глубину питательной среда
1. Отбирают определенные объемы разведений для исследования, касаясь наконечником пипетки боковой стенки пробирки, чтобы удалить избыточную жидкость с внешней стороны пипетки.
2. Поднимают крышку стерильной чашки Петри так, чтобы было возможно внести содержимое пипетки в чашку.
3. Расплавленную агаровую среду выливают при температуре 44 °С - 47 °С в каждую чашку Петри. Необходимо наливать расплавленную среду таким образом, чтобы избежать ее попадания непосредственно в инокулят (посевной материал).
4. Расплавленную среду и инокулят немедленно тщательно перемешивают для получения равномерного распределения микроорганизмов в питательной среде.
5. Далее чашки помещают на горизонтальную поверхность, чтобы дать время охладиться и затвердеть питательной среде (время затвердевания агара не должно превышать 10 мин).
6. После расплавления агаровой среды, доведенной до необходимого состояния, флакон из водяной бани высушивают сухим чистым полотенцем, чтобы предотвратить загрязнение чашек водой бани.
7. Необходимо следить, чтобы среда не попадала на внешнюю сторону флакона или на внутреннюю часть крышки чашки Петри во время разливки е чашки. Для этого флакон или колбу необходимо держать фактически в горизонтальном положении и воздержаться от возврата флакона в вертикальное положение между этапами разливки питательной среды.
8. Если в исследуемом продукте предполагается присутствие колоний (например, виды Proteus) с "ползучим" ростом, используют для анализа слой со стерильным "голодным" агаром или идентичной питательной средой, наносимой на затвердевший агар в чашки с посеянным материалом, чтобы предотвратить или свести к минимуму распространение такого "ползучего" роста.
Поверхностный посев
1. Методы посева, предназначенные для получения только поверхностных колоний на агаровых чашках, имеют некоторые преимущества по сравнению с методом разливки в чашки для выращивания микроорганизмов внутри агара. Микроорганизмы не подвергаются действию высокой температуры расплавленной агаровой среды, поэтому количество колоний может быть выше, а подсчет - более точным.
2. Используют предварительно заполненные агаровой средой чашки, толщина агарового слоя которых составляет не менее 3 мм. Слой агара должен быть ровным и не содержать пузырьков воздуха и поверхностной влаги.
3. Чтобы облегчить равномерное распределение, поверхность затвердевшего агара необходимо подсушить в соответствии с ISO/TS 11133 или, как определено другим соответствующим международным стандартом. В таком случае посевной материал абсорбируется в течение 15 мин.
Развитие управляющих функций мозга ребёнка: полезные советы и упражнения для педагогов
Сертификат и скидка на обучение каждому участнику
Государственное автономное образовательное учреждение
среднего профессионального образования Республики Крым
План занятия (практическое) № 9
Тема занятия: Изучение техники и методов посева клинических материалов и бактериальных культур.
Дисциплина (МДК )04.01. Теория и практика лабораторных микробиологических и иммунологических исследований
Специальность: 31.02.03. Лабораторная диагностика Курс: 1-ый
Цели занятия:
Образовательные:
Изучить методы посева клинических материалов и бактериальных культур
Ознакомиться с принципами культивирования микроорганизмов
Освоить технику посева истощающим штрихом, секторами, шпателем на плотные среды и посев в жидкую питательную среду
Развивающие:
Развивать навыки самообразования, творческие способности студентов
Продолжить развитие учебно-интеллектуальных умений;
выделять главное и существенное
устанавливать причинно-следственные связи
Воспитательные:
воспитывать уважение к людям, науки, их достижениям
продолжить формирования умения работать в коллективе, принимать совместные решения
продолжить формирования здорового образа жизни
Междисциплинарные связи:
Физико-химические методы исследования и техника лабораторных работ
Внутридисциплинарные связи:
Питательные среды и микробиологическое исследование
Место проведения: лаборатория 407
Тип занятия: практическое Количество часов: 4 академических
Обеспечение занятия: методическая разработка
Камышева К.С. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии Ростов н/Д: Феникс, 2015. – 281 с.
Студент должен уметь:
- готовить исследуемый материал, питательные среды, реактивы и оборудование для проведения микроскопических, микробиологических и серологических исследований;
- проводить микробиологические исследования клинического материала, проб объектов внешней среды и пищевых продуктов;
- осуществлять подготовку реактивов, лабораторного оборудования и аппаратуры для исследования;
Студент должен знать:
- задачи, структуру, оборудование, правила работы и техники безопасности в микробиологической лаборатории .
– общие характеристики микроорганизмов, имеющие значение для лабораторной диагностики
- требования к организации работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности
Студент должен обладать:
Общие компетенции
ОК 2. Организовывать собственную деятельность, выбирать типовые методы и способы выполнения профессиональных задач, оценивать их эффективность и качество.
ОК 3. Принимать решения в стандартных и нестандартных ситуациях и нести за них ответственность.
ОК 4. Осуществлять поиск и использование информации, необходимой для эффективного выполнения возложенных на него профессиональных задач, а также для своего профессионального и личностного развития.
ОК 5. Использовать информационно-коммуникационные технологии в профессиональной деятельности.
ОК 6. Работать в коллективе и команде, эффективно общаться с коллегами, руководством, пациентами.
ОК 7. Брать ответственность за работу членов команды (подчиненных), за результат выполнения заданий.
ОК 13. Организовывать рабочее место с соблюдением требований охраны труда, производственной санитарии, инфекционной и противопожарной безопасности.
Профессиональные компетенции
ПК 4.1. Готовить рабочее место и аппаратуру для проведения лабораторных микробиологических исследований.
ПК 4.2. Проводить лабораторные микробиологические и иммунологические исследования биологических материалов, проб объектов внешней среды и пищевых продуктов; участвовать в контроле качества.
ПК 4.3. Регистрировать результаты проведенных исследований
ПК 4.4. Проводить утилизацию отработанного материала, дезинфекцию и стерилизацию использованной лабораторной посуды, инструментария, средств защиты.
Структура занятия:
Организационный момент 2 мин.
Мотивация (цели) занятия 3 мин.
Оценка знаний студентов (проверка исходного уровня знаний) 30 мин.
Практическая часть 120 мин.
Итоговый контроль 15 мин.
Задание на дом 2 мин.
Подведение итогов занятия, оценка работы студентов 8 мин.
Ход занятия
Организационный момент
2. Мотивация (цели) занятия :
Изучение методов посева биологического материала на питательные среды для бактериологического исследования с целью изучения культуральных свойств микроорганизмов является необходимым элементом освоения программы профессионального модуля ПМ.04, поскольку представляет собой основной этап микробиологического исследования и является одним из профессиональных навыков медицинского лабораторного техника
3.Оценка знаний студентов (проверка исходного уровня знаний) :
а) проверка знаний : тесты по пройденному материалу (см. приложение)
в) подведение итогов контроля: Оценивание, замечания по работе.
4. Практическая часть:
а) подготовка студентов к самостоятельной работе ( проведение инструктажа по выполнению заданий):
б) самостоятельная работа студентов: (алгоритмы приготовления препаратов и методы окрашивания в приложениях)
Задание студентам для выполнения лабораторной работы:
Подготовить лабораторную посуду к разливу питательных сред
Приготовить МПА и МПБ, Кровяной агар
Провести посев различными методами
Записать алгоритмы посева и зарисовать схематически
Сделать выводы в дневнике
в) подведение итогов самостоятельной работы
Оформление в рабочей тетради выводов о проделанной работе
5. Итоговый контроль: Проверка преподавателем работ студентов
Подведение итогов занятия, оценка работы студентов
Преподаватель оценивает работу студентов, корректирует ошибки, отвечает на вопросы студентов
Преподаватель Гончарова А.И.
Биологическая стерилизация применяется при культивировании:
2. рН среды для культивирования холерного вибриона:
3. Окислительно-восстановительный потенциал для аэробов:
Среды состоящие из химических чистых веществ:
Плотные питательные среды содержат:
6. Среды для микроорганизмов, не растущих на простых питательных средах:
7. Питательные среды для определения ферментативной активности бактерий:
8. Среды накопления – это:
9. Второй этап приготовления питательных сред:
Б) определение рН
10. Стерилизация сред, содержащей углеводы осуществляется :
Б) дробной стерилизацией
11. Среды, предназначенные для транспортировки исследуемого материала:
12.Чистая культура – это:
А) выделенные из одной биологической жидкости
Б) выросшие на одной чашке Петри
В) Состоящие из микроорганизмов одного вида
Метод серийных разведений в агаре позволяет одновременно определить МПК партии штаммов (от 15 до 30 клинических штаммов + контрольные штаммы, в зависимости от используемой модели инокулятора).
Процедура
Принцип метода заключается в посеве тестируемых микроорганизмов на чашки Петри с агаром, содержащим последовательные двойные разведения антибиотиков. Одновременно проводится тестирование партии клинических штаммов и соответствующих контрольных штаммов, а также контроль роста микроорганизмов на чашках без АБП и контроль чистоты культуры путем высева образцов инокулюма на неселективные питательные среды.
Приготовление серийных разведений АБП
Из основного раствора исследуемого АБП готовят рабочий раствор в концентрации в 10 раз превосходящей максимальную из используемых в конкретном исследовании. Затем говят серию двукратных разведений рабочего раствора. Таким образом, концентрация в АБП в каждом последующем разведении должна быть в 2 раза меньшей чем в предыдущем. Для приготовления серии разведений используются любые стерильные химически инертные лабораторные ёмкости с завинчивающимися крышками объёмом не менее 10 мл (для удобства размешивания).
Питательная среда
Сухая агаризованная питательная среда растворяется и автоклавируется в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещаются на водяную баню при 48 - 50 °С, где выдерживаются до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора АБП на 9 частей расплавленного агара) и, при необходимости, термолабильные питательные добавки. Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды должна быть 3 - 4 мм.
Вторым способом приготовления чашек Петри с агаром, содержащим разведения АБП, является смешивание питательной среды и раствора АБП непосредственно в чашке Петри. Для приготовления стандартных пластиковых чашек диаметром 90 мм необходимо к 2 мл раствора АБП добавить 18 мл разогретого до 50 °С жидкого агара. Чашки предварительно маркируются с указанием препарата и его концентрации. Очень важно тщательно перемешивать агар до того, как он начнёт застывать для равномерного распределения АБП по всей толще питательной среды. Перемешивание производится на горизонтальной поверхности последовательно плавными разнонаправленными круговыми движениями чашки. После приготовления чашек агар должен затвердеть в горизонтальном положении. Нельзя резко передвигать, переносить чашки до полного застывания агара.
Параллельно с чашками Петри, содержащими растворы антибиотиков, для контроля роста готовят чашки Петри без антибиотиков. Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания и подсушивания на 10 - 12 ч.
Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно, однако допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при + 4 - + 8 °С в течение 5 сут. При этом необходимо иметь в виду, что некоторые бета-лактамные антибиотики (прежде всего, ампициллин, цефаклор, имипенем), особенно при низких концентрациях не выдерживают даже указанный срок хранения. В этой связи стабильность антибиотиков в приготовленных в лаборатории чашках Петри целесообразно устанавливать экспериментально с использованием референтных штаммов.
Приготовление инокулюма и инокуляция
Конечная посевная доза исследуемого микроорганизма на поверхности питательной среды должна составлять 10 4 КОЕ. Поскольку коммерческие инокуляторы или стандартная бактериологическая петля диаметром 3,0 мм переносят 1 - 2 мкл жидкости, концентрация микроорганизмов в исходной суспензии должна быть 10 7 КОЕ/мл. Такую концентрацию можно получить при разведении стандартной микробной суспензии, соответствующей стандарту 0,5 по МакФарланду, в 10 раз. Полученную суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин. после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5 - 8 мм.
Для контроля качества приготовления суспензий периодически рекомендуется проводить подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева образца приготовленного инокулюма на неселективные питательные среды.
Инкубация
После инокуляции чашки оставляют при комнатной температуре для подсыхания, далее переворачивают и инкубируют при температуре 35 °С в течение 18 - 24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма).
Учет результатов
Учет результатов проводят, поместив чашку на темную не отражающую свет поверхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста. Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать увеличение. Появление единственной колонии на чашке с концентрацией на 1 разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать. Результат оценки антибиотикочувствительности имеет смысл учитывать только при подтверждении чистоты культуры (см. контроль качества).
Контроль качества
При постановке методов серийных разведений в агаре необходимо проводить контроль роста культуры на чашке Петри с питательной средой, не содержащей АБП. Важнейшим требованием контроля качества является высев, использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду для подтверждения чистоты культуры! Каждая партия тестируемых штаммов сопровождается внутренним контролем качества исследования с использованием соответствующих контрольных (референтных) штаммов.
Общие замечания по методам серийных разведений
Несмотря на то, что методы серийных разведений являются наиболее точными и информативными, их постановка в практических лабораториях сопряжена со значительными методическим трудностями. Прежде всего речь идет о необходимости использования субстанций антибиотиков с известным уровнем активности, строгого соблюдения режимов хранения, тщательного выполнения контроля качества питательных сред, трудоемкости приготовления рабочих растворов антибиотиков.
Использование коммерческих тест-систем на основе метода микроразведений позволяет избегать трудоемких процедур по стандартизации подготовительных этапов, но при этом обеспечивает получение достоверных количественных результатов по уровню антибиотикорезистентности. Весьма экономичным и простым в исполнении является также вариант метода серийных микроразведений, основанный на использовании двух пороговых концентраций, позволяющий получить качественные результаты (т.е. распределить штаммы по чувствительности на три категории).
Читайте также: