Для определения общего микробного числа омч используют следующие методы посева
Добавил пользователь Alex Обновлено: 19.09.2024
Методы санитарно-микробиологического исследования микрофлоры продуктов питания и лекарственных средств.
Микрофлора пищевых продуктов
Многие пищевые продукты являются благоприятной средой для сохранения и размножения микроорганизмов. Микрофлору пищевых продуктов условно делят на специфическую (штаммы микроорганизмов, применяющиеся в технологическом процессе) и неспецифическую (случайные микроорганизмы, попадающие в пищевые продукты при их заготовке, доставке, переработке и хранении). Инфицирование пищевых продуктов микроорганизмами может приводить к возникновению у людей пищевых токсикоинфекций и других заболеваний.
Микробиологические критерии безопасности пищевых продуктов:
1) санитарно-показательные микроорганизмы (бактерии группы кишечной палочки – представители родов Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Serratia);
2) потенциально-патогенные микроорганизмы (коагулазоположительные стафилококки, бактерии рода Proteus,сульфитредуцирующие клостридии, Bacillus cereus)
3) патогенные микроорганизмы (сальмонеллы и др.);
4) показатели микробиологической стабильности продукта (дрожжи, плесневые грибки).
Санитарно-бактериологическое исследование пищевых продуктов проводят в несколько этапов.
1. Отбор проб проводят стерильными инструментами в стерильную посуду.
2. Определение ОМЧ (общего количества микроорганизмов, содержащихся в 1 г или 1 см 3 продукта). Для его определения используют методы кратных и продольных разведений:
- метод кратных разведений. Плотные субстраты измельчают и готовят исходную взвесь в разведении 1:1. Из полученной взвеси или исходного жидкого субстрата готовят ряд последующих разведений в физиологическом растворе с таким расчетом, чтобы при посеве двух последних разведений на чашке Петри выросло 50–300 колоний. Из двух последних разведений по 1 см 3 вносят в чашки Петри и заливают 10–15 мл расплавленного и остуженного питательного агара. Чашки инкубируют при 37ºС 48 часов, затем подсчитывают число выросших колоний и рассчитывают ОМЧ с учетом разведения исследуемого материала.
- метод предельных разведений (титр). Из исходного жидкого субстрата готовят ряд десятикратных разведений до тех пор, пока в последней пробирке можно будет предположить наличие одной бактериальной клетки. Посев делают в жидкую элективную среду с последующим выделением микроорганизмов на плотной среде и изучением их характеристики. За титр принимают то наименьшее количество субстрата, в котором обнаружена одна клетка исследуемого микроорганизма.
3. Определение санитарно-показательных микроорганизмов, которые характеризуют продукт с точки зрения эпидемической опасности. В основном это бактерии группы кишечной палочки (БГКП), для их количественного учета используют методы определения наиболее вероятного числа (НВЧ) и титра БГКП.
- Для определения НВЧ из исследуемого продукта делают разведения 10–1, 10–2, 10–3, из которых по 1 см 3 засевают в три пробирки со средой Кесслера (для каждого разведения). Через 24 часа инкубации при 37ºС в пробирках регистрируется изменение цвета седы и газообразование. В зависимости от числа проросших пробирок определяют НВЧ колиформных бактерий.
- Для определения титра БГКП готовят десятикратные разведения анализируемого материала и высевают на среду Кесслера для выявления наименьшего количества продукта, в котором присутствуют колиформные бактерии. Посевы термостатируют при 43ºС в течение 18–24 часов. Из каждой пробирки производят высев на чашки Петри со средой Эндо так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37ºС 18–24 часа, после чего из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек материал колоний пересеваю на среды Гисса с глюкозой. При наличии газообразования в пробирках с посевами констатируют присутствие БГКП. Титр устанавливают по наименьшему количеству продукта, в котором обнаружены БГКП, или по стандатным таблицам.
4. Обнаружение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (сальмонелл, стафилококка, протея, патогенных грибков). Для этого взвеси исследуемых продуктов засевают на среды накопления (селенитовый, хлористо-магниевый бульоны). После суточной инкубации при 37ºС производят пересев на плотные элективные среды (Эндо, Левина, Плоскирева, висмутсульфитный и желточно-солевой агар). Далее материал колоний индентифицируют путем учета особенностей роста на средах Гисса, Ресселя, Олькеницкого и в реакциях агглютинации с моновалентными сыворотками.
Микрофлора лекарственного сырья и готовых лекарств
Лекарственное растительное сырье (ЛРС) может обсеменяться микроорганизмами на всех этапах заготовки, переработки и хранения. Внешние проявления микробной порчи ЛРС – изменение цвета и консистенции, загнивание, плесневение, появление несвойственного запаха. При этом резко снижается содержание биологически активных веществ, использование такого сырья становится бесполезным. Состав микроорганизмов зависит от вида ЛРС, его структуры и химического состава. Преобладают грибки (Mucor, Penicillum, Aspergillus, Candida), актиномицеты и спорообразующие бактерии (Bacillus subtilis, B. megaterium).
Микробной порче подвергаются также и готовые лекарственные формы (ЛФ). Лекарства с повышенной обсемененностью микробами могут вызывать инфекционные заболевания, размножение микроорганизмов в лекарственных средствах приводит к изменению их физических и органолептических свойств, а в отдельных случаях и к превращению лекарств в токсический продукт.
Предупреждение микробной порчи готовых лекарственных препаратов возможно при соблюдении условий, исключающих их микробное загразнение: соблюдение правил личной гигиены сотрудниками аптек и фармацевтических производств, правильная обработка посуды и оборудования, обеззараживание воздуха; при необходимости – изготовление ЛФ в асептичесикх условиях.
Инъекционные препараты, глазные капли и мази должны быть стерильными. Остальные ЛФ являются нестерильными и легко подвергаются обсеменению микроорганизмами.
Бактериологический контроль ЛФ и ЛРС проводят также в несколько этапов по методикам, приведенным выше:
1) определение ОМЧ (общей обсемененности в 1г или 1мл препарата);
2) определение БГКП;
3) определение дрожжевых и плесневых грибов;
4) определение условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (по специальным показателям).
В соответствии с требованиями Государственной фармакопея XI издания приняты критерии оценки микробной обсемененности лекарственных средств, приведенные в таблице 5.
Нормативы предельно допустимого содержания непатогенных
микроорганизмов в лекарственных формах
Для оценки санитарно-бактериологического состояния воздуха определяют следующих показателей: микробного числа воздуха (количество микробов в в 1м 3 воздуха) методами осаждения по Коху и аспирации по Кротову, наличие зеленящего стрептококка путем посева воздуха на кровяной агар с добавлением генцианового фиолетового (среда Гарро), для обнаружения S. aureus – на желточно-солевой агар, для обнаружения других патогенных бактерий – соответствующие элективные питательные среды.
Определение микробного числа воздуха методом Коха проводится в 2 этапа:
1 этап. Отбор пробы воздуха. Стерильные чашки Петри с МПА открывают в месте отбора проб воздуха и выдерживают в течение 10 мин, после чего закрывают и инкубируют при 37 0 С в течение 48 часов.
2 этап. Учет результатов. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь формулой Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100см 2 в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха:
Х – количество микробов в 1м 3 воздуха
X = а – число колоний, выросших на чашке
в – площадь чашки Петри, равная ПR 2
Метод Кротова является более точным методом определения микробного числа воздуха с помощью специального прибора.
БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД И МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ ПО ВИРУЛЕНТНОСТИ
Заражение экспериментальных животных
Биологический метод)
Заражение экспериментальных животных может производиться в целях:
1) идентификации микроорганизмов по вирулентности;
2) выделения чистой культуры возбудителя из различных материалов и ее идентификации;
3) воспроизведения и изучения инфекционного процесса;
4) испытания лечебного эффекта химиотерапевтических и иммунологических препаратов.
5) получения иммунобиологических лечебно-профилактических и диагностических препаратов и др.
В зависимости от цели исследования заражают различных животных (кроликов, морских свинок, белых мышей, белых крыс и др.) различными способами: накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутривенно, перорально, интраназально, внутритрахеально, интрацеребрально и внутрибрюшинно.
Внутрибрюшинное заражение белых мышейс целью:
1) идентификации выделенной чистой культуры S.aureus по вирулентности;
2) установления формы инфекции по происхождению, локализации, длительности течениия, количеству возбудителя и др.
План работы первого этапа:
1. Суточную агаровую культуру S.aureus проверяют на чистоту
(готовят мазок и окрашивают по Граму).
2. Стерильным физ. раствором смывают культуру и готовят микробную взвесь соответствующей оптическому стандарту мутности (1мл – 1 мрд.мкр.тел)
3. Взвесь микробов (0,5 мл) набирают в шприц.
4. Заражают внутрибрюшинно белую мышь. Берут мышь левой рукой за хвост, фиксируют её в растянутом состоянии брюшком верх, головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. В левой нижней трети живота делают прокол кожи под острым углом, затем устанавливают шприц под прямым углом, толчкообразным движением прокалывают брюшину и вводят содержимое шприца.
5. Зараженных животных маркируют и отправляют в лабораторию. Инструменты до и после заражения стерилизуют кипячением.
Второй этап. Вскрытие трупа с целью обнаружения возбудителя и идентификации путем микроскопического исследования и выделения чистой культуры.
План исследования:
Мышь фиксируют брюшком вверх в специальной подставке. Шерсть и кожу обрабатывают спиртом.
1.Макроскопическое исследование. Тщательно осматривают наружные покровы. Затем делают разрез кожи по прямой линии от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы к лапкам. Отсепаровывают кожу в обе стороны от разреза. Отметить состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов. Обращают внимание на внешний вид лёгких, сердца. Осмотреть органы брюшной полости, характер экссудата, величину, цвет и консистенцию печени и селезенки.
2. Микроскопическое исследование. Приготовить следующие мазки и окрасить их методом Грама::
а) мазок из крови сердца;
б) мазок-отпечаток легкого;
в) мазок из асцитической жидкости (экссудата);
г) мазок- отпечаток печени;
д) мазок- отпечаток селезенки.
При микроскопии отмечают присутствие микроба-возбудителя в различных органах и тканях и по результатам исследования мазков оформить предварительное заключение.
3.Бактериалогические исследование. Параллельно с приготовлением мазков сделать посевы из тех же органов на 5 пробирок с МПБ:
а) для посева крови из сердца участок его поверхности прижигают раскалённым скальпелем и через прижжённый участок вводят капилляр стерильной пастеровской пипетки в полость сердца. Затем каплю крови из пипетки выдувают в пробирку с МПБ и на предметное стекло для приготовления мазка (мазок фиксируют спиртом в течение 3-5 минут);
б) из ткани лёгкого делают посев кусочка ткани в МПБ и приготовляют мазок – отпечаток;
в) разрезают брюшную стенку ножницами от диафрагмы до лобка. Обращают внимание на наличие экссудата, который собирают пастеровской пипеткой и засевают в МПБ. Каплю экссудата наносят на предметное стекло для окрашивания. Для приготовления мазков-отпечатков вырезают из печени, селезенки небольшие кусочки ткани, берут их пинцетом и прикасаются к предметному стеклу поверхностью разреза. Мазки-отпечатки фиксируют термическим способом;
г) результат посевов учитывают на следующий день после инкубации в термостате. Труп животного после вскрытия подлежит уничтожению;
д) учесть результаты посевов на питательных средах и оформить окончательное заключение (ответить на вопросы: 1.Вирулентна ли культура S.aureus? 2.Какие факторы вирулентности S.aureus Вы обнаружили? 3.От какой формы инфекции погибла мышь?).
© 2014-2022 — Студопедия.Нет — Информационный студенческий ресурс. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав (0.004)
Развитие управляющих функций мозга ребёнка: полезные советы и упражнения для педагогов
Сертификат и скидка на обучение каждому участнику
Описание презентации по отдельным слайдам:
Санитарная микробиология – направление медицинской микробиологии, изучающее микрофлору окружающей среды и ее влияние на здоровье человека и на состояние среды его обитания.
Задачи санитарной микробиологии:
Исследование объектов внешней среды (воздух, почва, вода) для оценки их воздействия на здоровье человека.
Обследование здоровых лиц (работников пищевых, детских, лечебных учреждений) на носительство патогенных микроорганизмов.
Исследование пищевых продуктов с целью их гигиенической характеристики и эпидемиологической оценки; проведение специальных анализов на наличие патогенных микробов при пищевых отравлениях.
Контроль за дезинфекционными мероприятиями.
Принципы проведения санитарно- микробиологических исследований
Пробы отбирают с соблюдением всех условий, регламентированных для каждого исследуемого объекта.
Исследования проводят быстро; допускается хранение материала в холодильнике не дольше 6 - 8 часов.
Для получения объективных результатов отбирают несколько проб из разных участков объекта, а также проводят повторные отборы и анализы проб.
Используют только стандартные и унифицированные методы исследования.
В работе используют комплекс тестов:
а) прямые – выявляют патогенные микроорганизмы,
б) косвенные – указывают на загрязнение объектов окружающей среды выделениями человека и животных.
Интерпретацию результатов санитарно- микробиологических исследований проводят с учетом других гигиенических показателей (химических, физических, органолептических и др.).
Методы санитарной микробиологии
Микроскопический
Бактериологический
Биологический (в основном для определения токсинов)
Микологические
Вирусологические
Проведение санитарно- микробиологических исследований направлено на:
Определение общего микробного числа (ОМЧ) исследуемого объекта;
Определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ) в исследуемом объекте;
Выявление в исследуемых объектах патогенных микроорганизмов.
Общее микробное число (ОМЧ) – это общее количество микроорганизмов в единице объема или массы исследуемого объекта (в 1 мл или в 1 г).
Чем выше ОМЧ объекта, тем выше возможность присутствия в нём патогенных микроорганизмов.
Методы определения ОМЧ:
- прямой подсчет бактерий в счетных камерах с помощью обычного или фазово-контрастного микроскопа,
- количественный посев на плотные питательные среды.
Определение ОМЧ воздуха
Проводится в закрытых помещениях
Используют:
седиментационный метод
открытые чашки Петри со стерильной питательной средой расставляют в помещении. Бактерии из воздуха оседают на поверхность среды, затем чашки закрывают, инкубируют и подсчитывают количество выросших колоний.
аспирационный метод
Используют специальные аппараты, например, аппарат Кротова.
Скорость протягивания воздуха в среднем 25 л/мин.
ОМЧ определяют в 100 л воздуха.
На пути струи воздуха помещают чашку Петри с питательной средой, в результате чего бактерии из воздуха засеваются на среду. Затем инкубируют посевы и подсчитывают число колоний.
Нормы ОМЧ регламентированы для воздуха различных помещений.
Санитарно-показательные микроорганизмы (СПМ)
- это микроорганизмы, указывающие на загрязнение внешней среды выделениями человека или животных.
Присутствие СПМ в объекте внешней среды указывает на возможность наличия в этом объекте других, в т.ч. патогенных для человека, микроорганизмов, непосредственное обнаружение которых затруднено.
СПМ являются постоянные обитатели естественных полостей человека или животных, которые постоянно выделяются в окружающую среду.
СПМ делят на 3 группы:
группа А включает обитателей кишечника человека и животных, их расценивают как индикаторы фекального загрязнения (эшерихии, энтерококки, протеи, клостридии и др.),
группа В включает обитателей верхних дыхательных путей, их расценивают как индикаторы орального загрязнения (стрептококки, стафилококки),
группа С включает сапрофитические микроорганизмы, обитающие во внешней среде, их расценивают как индикаторы процессов самоочищения (бактерии-аммонификаторы, бактерии-нитрификаторы, грибы, актиномицеты, синезеленые водоросли).
СПМ различных объектов внешней среды
При количественном определении СПМ результаты исследований выражаются в 2 величинах:
- Индекс СПМ (например, коли-индекс)
- это количество СПМ, обнаруженное в единице объема или массы исследуемого объекта.
Для определения индекса СПМ используют:
1) метод мембранных фильтров,
2) метод бродильных проб.
- Титр СПМ (например, коли-титр)
- это наименьшее количество исследуемого объекта, в котором обнаружена хотя бы одна особь СПМ.
Сущность метода мембранных фильтров заключается в фильтровании определенных объемов исследуемой жидкости (или твердого вещества, разведенного в воде) через мембранные фильтры, на которых задерживаются бактерии. Фильтры переносят на чашки со средой Эндо, инкубируют при + 37°, а затем подсчитывают выросшие на фильтре колонии кишечной палочки и проводят перерасчет на 1 л, 1 кг или 1 г в зависимости от исследуемого материала.
Сущность метода бродильных проб заключается в посеве определенных объемов исследуемого субстрата на глюкозопептонную среду с индикатором и поплавком (для определения ферментации глюкозы), которые выдерживают при + 37°. Из всех помутневших пробирок делают высевы на среду Эндо с последующей идентификацией выросших колоний.
Коли-титр — величина, обратная коли-индексу.
Патогенные микроорганизмы (ПМ)
Обнаружение ПМ в объектах внешней среды производится:
путем прямого посева на питательные среды
путем посева после предварительной концентрации микроорганизмов с помощью фильтрации, центрифугирования, осаждения коагулянтами и т.д.
Идентификация ПМ производится согласно общепринятым схемам.
Согласно ГОСТу: “патогенные микроорганизмы и их токсины должны отсутствовать в питьевой воде и пищевых продуктах”.
Классификация
Семейство Enterobacteriobacteriaceae
Род Klebsiella включает в себя 4 вида: K.pneumoniae, K.oxytoca, K.planticola, K.terrigena.
В патологии человека наибольшее значение имеют K.oxytoca и K.pneumoniae, состоящий из трех подвидов: K.pneumoniae, K. ozaenae и K.rhinoscleromatis.
Относятся к V группе по Берджи (гр- мелкие палочки с закругленными концами, факультативный анаэроб).
Не имеют спор, неподвижны, имеют микрокапсулу
Оппортунистические инфекции (от лат. opportunus — удобный, выгодный, и лат. infectio — заражение, также англ. opportunity — возможность) — заболевания, вызываемые патогенами (бактерии, вирусы, грибы, простейшие), которые обычно не приводят к болезни у здоровых особей (с нормальной иммунной системой). Например, оппортунистическими инфекциями заражаются лица с иммунодефицитными состояниями.
Внутрибольничные инфекции (также госпитальные, нозокомиальные) — согласно определению ВОЗ, любые клинически выраженные заболевания микробного происхождения, поражающие больного в результате его госпитализации или посещения лечебного учреждения с целью лечения, а также больничный персонал в силу осуществления им деятельности, независимо от того, проявляются или не проявляются симптомы этого заболевания во время нахождения данных лиц в стационаре
Klebsiella pneumoniae классифицируется как условно-патогенный микроб, находящийся в норме в определенных органах (например, в ЖКТ) в симбиотическом отношении с человеческим организмом, а в иных ситуациях являющийся причиной инфекционных заболеваний (например, при снижении общего и местного иммунитета).
Может вызвать пневмонию, плевриты, перикардиты, гаймориты, инфекции мочевыводящих путей, мозговых оболочек, суставов, абсцессы различной локализации, пищевые токсикоинфекции и даже сепсис.
Klebsiella rhinoscleromatis вызывает склерому - гранулематозное поражение слизистой оболочки носа (риносклерома) и верхних дыхательных путей. Характерно появление плотных узлов красного, розового, бледного цвета, сливающихся в опухоль хрящевой плотности. Поражению подвергаются ноздри, мягкое нёбо, язычок укорачивается, глотка и гортань стенозируются.
Klebsiella ozaenae вызывает озену — зловонный насморк, характеризующийся атрофическим процессом слизистой оболочки и костных стенок полости носа, сопровождающийся образованием секрета, засыхающего в зловонные корки, плотным слоем покрывающие слизистую оболочку. Могут поражаться глотка, гортань, трахея.
Klebsiella pneumoniae
(окраска по Бурри-Гинсу)
Клебсиеллы не требовательны к питательным средам. В МПБ образуют диффузное помутнение, а на МПА растут в виде слизистых, блестящих колоний.
Принципы микробиологической диагностики клебсиелл основаны на выделении и идентификации возбудителя.
Материал для исследований клебсиелл — кровь, СМЖ, гнойное отделяемое, испражнения, смывы и др.
Образцы засевают на селективно-дифференциальную среду К-2 (с мочевиной, рафинозой и бромтимоловым синим).
Колонии клебсиелл сочные и блестящие, имеют цвет от жёлтозеленого до голубого. Культуральные и биохимические особенности клебсиелл определяют на минимальном дифференцировочном ряду
Антигенную структуру клебсиелл исследуют в РА живой культуры диагностическими К-антисыворотками.
Для выявления AT применяют РСК
Род Proteus относится к семейству Enterobacteriaceae и включает в себя три вида. Важную роль в патологии, особенно в качестве возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний и пищевых токсикоинфекций, играют два вида:
P. vulgaris и P. mirabilis.
Все представители рода Proteus – грамотрицательные палочки с закругленными концами, размером 0,4 – 0,6 х 1 – 3 мкм, спор и капсул не образуют. Склонны к полиморфизму, наблюдаются кокковидные и нитевидные формы. Иногда встречаются и неподвижные варианты, лишенные жгутиков (О-форма). Факультативные анаэробы. Температурный оптимум 37 °С, рН 7,2 – 7,4; температурные пределы роста от 20 до 38 "С.
Сырое молоко - молоко, не подвергавшееся термической обработке при температуре более чем 40С или обработке, в результате которой изменяются его составные части.
Сырое молоко может содержать опасные микроорганизмы, которые могут вызывать инфекционные болезни. Сырое молоко занимает первое место среди продуктов, употребление которых, связано с риском получить серьезное заболевание.
Целью нашей работы явилось изучить уровень микроорганизмов в сыром молоке. В связи с этим, перед нами была поставлена задача: определить уровень общего микробного числа в молоке, а именно КМАФАнМ (количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов).
Определение КМАФАнМ проводили согласно действующего ГОСТ Р 53430-2009. Метод основан на способности мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном агаре при 30±1°С в течение 72 ч.
Из сырого молока готовили последовательные десятикратные разведения, из которых делали посев в питательные среды (таблица 1).
Читайте также: