Для определения наличия плазмокоагулазы производят посев

Добавил пользователь Alex
Обновлено: 18.09.2024

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и эпидемиологии, и может быть использовано при бактериологической диагностике и эпидемиологическом анализе гнойно-септических и нозокомиальных стафилококковых инфекций.

Род Staphylococcus, включающий 31 вид, играет важную роль в инфекционной патологии. Наибольшее значение в медицинской микробиологии имеют золотистый (S.aureus), эпидермальный (S.epidermidis) и сапрофитический (S.saprophyticus) стафилококки. Однако в последние годы в клиническом материале и во внешней среде лечебно-профилактических учреждений все чаще обнаруживают стафилококки, идентификация которых затруднена.

Наиболее близким аналогом представленного в заявке метода является способ видовой дифференциальной диагностики стафилококков согласно Определителю бактерий Берджи. (John G., Holt, Noel R. Krieg, Peter H.A. Sneath, James Т Stanley T. Williams Bergey's Manual of determinative bacterioloji Ninth Edition - Baltimor-Philadelphia-Hon Kong-London et al. - 1997. - V.2. - P.553-559). Идентификация стафилококков, выделенных от больных с гнойно-септической патологией и из внешней среды, осуществляется данным способом после определения их семейственной и родовой принадлежности по классическим методикам на стандартных питательных средах и режиме культивирования с использованием 48 признаков, включающих диаметр колоний, наличие пигмента, характер роста в различных условиях инкубации и при определенном составе питательных сред, образование кислоты из аминокислот, сахаров, спиртов, ферментативной активности, устойчивости к новобиоцину и др.

Его недостатком является большое количество и сложность постановки дифференцирующих тестов, используемых при проведении исследований.

Техническим результатом изобретения является повышение степени достоверности видовой дифференциальной диагностики стафилококков и сокращение сроков анализа.

Определение 4-х ведущих биологических свойств у стафилококков: фактора хлопьеобразования, ферментов плазмокоагулазы и уреазы, чувствительности к новобиоцину с последующим включением в ход микробиологического анализа 12-ти дифференцирующих тестов (вместо 48), позволяет достоверно определить их принадлежность к виду и значительно сократить сроки диагностики (3-4 дня).

Сущность изобретения заключается в следующем. Путем дифференциации тестов по определению биологических свойств стафилококков, выделенных из клинического материала и из внешней среды с использованием классических питательных сред и стандартного режима инкубации, исследуют ведущие признаки по определению фактора хлопьеобразования, ферментов плазмокоагулазы и уреазы, чувствительности к новобиоцину. Это позволит сформировать стафилококки в группы, в каждой из которых используют комбинации признаков, включающих определение гемолитической активности, размера колоний, β-галактозидазы, пигментообразования, роста культуры в режиме инкубации при 45°С в анаэробных условиях, способность к разложению сахарозы, галактозы, маннита, маннозы, ксилозы и арабинозы, и по этим признакам определяют видовую принадлежность возбудителя.

Определение принадлежности стафилококков к 31-му виду представлено на чертеже.

При этом в группе стафилококков, обладающих фактором хлопьеобразования, исследуют наличие плазмокоагулазы, способность к разложению сахарозы, маннита и гемолитическую активность. В группе коагулазоположительных стафилококков с уреазной активностью, чувствительных к новобиоцину, - наличие β-галактозадазы, способность к росту при 45°С, разложению маннозы, сахарозы галактозы и маннита. В группе коагулазоотрицательных стафилококков с уреазной активностью, чувствительных к новобиоцину, - β-галактозидазы, утилизацию сахарозы, маннозы, галактозы, маннита, способность к росту в условиях анаэробиоза, при температурном режиме 45°С. В группе коагулазоотрицательных стафилококков без уреазной активности, чувствительных к новобиоцину, - образование кислоты из маннозы, галактозы, сахарозы, маннита, наличие β-галактозидазы и гемолиза. В группе коагулазоотрицательных стафилококков с уреазной активностью, устойчивых к новобиоцину, - разложение сахарозы, ксилозы, арабинозы, маннита, способность к росту при 45°С и в условиях анаэробиоза. В группе коагулазоотрицательных стафилококков, не обладающих уреазной активностью, устойчивых к новобиоцину - разложение сахарозы, ксилозы, арабинозы, рост в анаэробных условиях, цвет и размер колоний. Это позволит определить принадлежность стафилококков к 31 виду (чертеж).

Способ осуществляется следующим образом: исследуемую чистую культуру-колонию стафилококка после определения родовой принадлежности со среды первичного посева исследуют на фактор слипания (хлопьеобразования). Этот признак является определяющим для данной группы.

Группа коагулазо- и уреазоположительных стафилококков, чувствительных к новобиоцину: S.delfini, S.scheiferi (supsp. coagulans), S.hyicus. У них определяют три признака: способность образовывать кислоту из сахарозы, галактозы и маннита. S.delfini образует кислоту из сахарозы и маннита, S.scheiferi (supsp. coagulans) - только из галактозы, S.hyicus - из сахарозы (табл.2).

Таблица 2.
Коагулазоположительные стафилококки с уреазной активностью, чувствительные к новобиоцину вид сахароза галактоза маннит S.delfini + . + S.hyicus + - - S.schleiferi (coagulans) d + d

При наличии роста в анаэробных условиях, положительного теста на β-галактозидазу учитывают способность стафилококка образовывать кислоту из маннозы. У S.felis данный тест положительный, у S.simulans - отрицательный (табл.3).

Таблица 3.
Коагулазоотрицательные стафилококки с уреазной активностью, чувствительные к новобиоцину, растущие в анаэробных условиях, обладающие β-галактозидазой вид манноза сахароза галактоза МПА 45°С. маннит S.felis + d d + d S.simulans - + d + +

Отсутствие роста в анаэробных условиях и отрицательная проба с β-галактозидазой позволяет отнести стафилококк в подгруппу: S.hominis, S.capitis (subsp. urealyticus). При этом варианте оценивают тесты с маннозой и маннитом. S.capitis (urealyticus) разлагает эти углевод и сахар, S.hominis - не разлагает (табл.5).

Таблица 5. Коагулазоотрицательные стафилококки с уреазной активностью, чувствительные к новобиоцину, не растущие в анаэробных условиях вид β-гал. манноза сахароза галактоза маннит S.hominis - - + d - S.capitis (urealyticum) - + + - +

Коагулазоотрицательные стафилококки с уреазной активностью, устойчивые к новобиоцину, составляют группу из 6 видов: S.klosii, S.cochni (subsp. urealyticus), S.saprophyticus, S.gallinarum, S.xylosus, S.equorum. В ней видовую принадлежность определяют по следующим признакам: образованию кислоты из сахарозы, ксилозы, арабинозы и маннита, росту в анаэробных условиях и росту при температуре 45°С. По способности разлагать сахарозу стафилококки делят на две подгруппы. Из подгруппы сахарозоположительных (S.saprophyticus, S.gallinarum, S.xylosus, S.equorum) лишь один вид - S.saprophyticus не разлагает ксилозу и арабинозу. S.gallinarum в отличие от S.xylosus и S.equorum не растет при 45 градусов, a S.xylosus в отличие от S.equorum не разлагает манит. В подгруппу сахарозоотрицательных входят S.klosii и S.cochni (subsp. urealyticus). Друг от друга они отличаются ростом в анаэробных условиях. В глубине тиогликолевой среды не растет S.klosii, а у S.cochni (subsp. urealyticus) этот тест положительный (табл.7)

Таблица 7.
Коагулазоотрицательные стафилококки с уреазной активностью, устойчивые к новобиоцину вид сахароза ксилоза арабиноза СКС МПА 45°C маннит S.kloosii - - d - . . S.cohni (urealuticum) - - - + + . S.saprophyticus + - - + d . S.gallinarum + + + + + . S.xylosus + + + d - - S.equorum + + + - - +

В группу коагулазоотрицательных стафилококков, не разлагающих мочевину и устойчивых к новобиоцину, входят 5 видов: S.arlette, S.sciuri, S.lentus, S.cochni (subsp. cochni), S.klosii. Здесь оценивают 4 теста: способность штамма образовывать кислоту из сахарозы, ксилозы, арабинозы и расти в анаэробных условиях. Все указанные признаки имеет S.arlette, в том числе образовывать кислоту из сахарозы. Кроме него в подгруппу сахарозоположительных стафилококков входят S.sciuri и S.lentus. Они отличаются друг от друга ростом в анэробных условиях. У S.sciuri этот признак присутствует. В подгруппе сахарозоотрицательных стафилококков (S.cochni (subsp. cochni), S.klosii) помимо этого оценивают способность к росту в условиях анаэробиоза. Растет в анаэробных условиях S.cochni (subsp. cochn), a S.klosii - нет (табл.8).

Таблица 8.
Коагулазоотрицательные стафилококки без уреазной активности, устойчивые к новобиоцину вид сахароза ксилоза СКС арабиноза Вид колоний S.arlettae + + + + оранжево-желтые S.sciuri + - + d более 5 мм S.lentus + - - d менее 5 мм S.cochni (cochni) - - + - . S.klosii - - - d

Примеры конкретного выполнения.

При бактериологическом исследовании содержимого трофической раны у больной 3. (ист. бол. №2178) на секторе 5% кровяного агара через 20 часов инкубации выросли крупные колонии диаметром 3 мм. В мазках - грамположительные кокки, каталазоположительные. Тест на фактор хлопьеобразования - отрицательный. Через 18 часов после пересева культуры были положительными тесты с кроличьей плазмой и уреазой. Зона задержки роста вокруг диска с новобиоцином составила 23 мм. Через 20 часов инкубации после постановки дифференцирующих тестов произошло образование кислоты из сахарозы, пробы с галактозой и маннитом - отрицательные.

Таким образом, у больной З. с трофической раной из клинического материала выделен коагулазоположительный стафилококк с уреазной активностью, чувствительный к новобиоцину, не обладающий фактором слипания. А отсутствие способности разлагать галактозу и маннит, но при этом утилизировать сахарозу позволяет отнести стафилококк к виду S.hyicus.

После первичного посева и 20 часов инкубации при температуре 36°С содержимого цервикального канала, взятого у больной М. (история болезни №123) с кольпитом, на поверхности кровяного агара выросли белые колонии диаметром 3 мм. В мазке, окрашенном по Грамму, обнаружены тетрады грамположительных кокков. Проба с каталазой положительная. Эти признаки позволяют отнести культуру к роду стафилококка. Тест на хлопьеобразование - отрицательный. Изучаем признаки на чувствительность к новобиоцину, образование уреазы и плазмокоагулазы. Через 18 часов инкубации проба с мочевиной положительная, с плазмокоагулазой отрицательная. Зона задержки роста культуры (разведенной по стандарту мутности 0,5 McFarland и посеянной на среду Мюллера-Хинтона) вокруг диска с новобиоцином (концентрация препарата в диске 5 мкг) составила 18 см, что говорит о чувствительности штамма стафилококка к новобиоцину. Культуру определяем к группе коагулазоотрицательных стафилококков с уреазной активностью, чувствительных к новобиоцину. На следующем этапе в состав изучаемых признаков у испытуемого штамма включаем: способность к образованию кислоты из сахарозы, маннозы, галактозы, маннита, образование β-галактозидазы, росту на тиогликолевой среде (в условиях анаэробиоза) и при 45°C на мясопептонном агаре. После 18 часовой инкубации тест с галактозой отрицательный, рост в анаэробных условиях отсутствовал, но были положительными тесты с маннозой, сахарозой и маннитом. Аэробный характер роста и отрицательный тест с β-галактозидазой определяет культуру в подгруппу с видами S.hominis и S.capitis (subsp. urealyticus). А положительные тесты с маннозой и маннитом позволяют дифференцировать штамм как S.capitis (subsp. urealyticus).

Таким образом, у больной с кольпитом из цервикального канала был выделен стафилококк, не обладающий фактором слипания, чувствительный к новобиоцину, разлагающий уреазу, не коагулирующий кроличью плазму, образующий кислоту из маннозы, сахарозы и манита и не образующий - из галактозы, а также не растущий в анаэробных условиях, что позволяет его отнести к виду S.capitis (subsp. urealyticus).

После забора содержимого эндотрахеальной трубки у больного М. (ист. бол. №357), посева на кровяной агар и инкубации в стандартном режиме на поверхности питательной среды выросли колонии размером 3-4 мм с зоной гемолиза. Фактор слипания - отрицательный. Тесты по образованию плазмокоагулазы и уреазы данные ферменты не выявили. Культура показала высокую чувствительность к новобиоцину (диаметр зоны отсутствия роста вокруг диска с антибиотиком составил 30 см). Определение сахаролитической активности выявило: отсутствие образования кислоты из маннозы и галактозы и, напротив, образование - из сахарозы и маннита. Выделенная культура не обладала β-галактозидазой.

Таким образом, из эндотрахеальной трубки больного М. был выделен коагулазоотрицательный стафилококк, не обладающей уреазной активностью, чувствительный к новобиоцину, разлагающий сахарозу и манит и не разлагающий маннозу и галактозу, имеющий фермент β-галактозидазу и обладающий гемолитической активностью, что позволяет его определить к виду S.haemolyticus.

При посеве средней порции мочи у беременной Ш. (ист. бол. №1321) с пиелонефритом на секторе кровяного агара после 24 часовой инкубации при 36°С, выросли белые негемолитические колонии диаметром 4 мм. В мазках - грамположительные кокки, расположенные тетрадами. Фактор слипания - отрицательный. Тест с мочевиной - положительный, зона задержки роста вокруг диска с новобиоцином отсутствует, тест на плазмокоагулазу - отрицательный. Культуру отнесли к группе коагулазоотрицательных сафилококков с уреазной активностью, устойчивых к новобиоцину, и включили в дифференцирующие тесты: сахарозу, ксилозу, арабинозу, маннит, произвели посев в тиогликолевую среду (для оценки роста в анаэробных условиях) и на мясопептонный агар при 45°C. Через 22 часа штамм образовал кислоту из сахарозы. Остальные пробы были отрицательные. Это позволяет отнести микроорганизм в подгруппу сахарозоположительных стафилококков (S.saprophyticus, S.gallinarum, S.xylosus, S.equorum), а отрицательные тесты с ксилозой и арабинозой определяют его принадлежность к виду S.saprophyticus.

При исследовании смыва с поверхности стола в операционной гинекологического отделения после посева на желточно-солевой агар и 20 часовой инкубации при 37°C, на поверхности среды выросли белые колонии диаметром 3 мм. После постановки тестов было установлено отсутствие фактора слипания, плазмокоагулазы, уреазы, чувствительности к новобиоцину. После дополнительного изучения признаков - неспособность штамма разлагать сахарозу, ксилозу, арабинозу, но произошел рост испытуемой культуры в глубине среды для контроля стерильности.

Таким образом, из внешней среды гинекологического отделения был выделен коагулазоотрицательный стафилококк, не обладающий уреазной активностью, устойчивый к новобиоцину, не разлагающий сахарозу, ксилозу, арабинозу, растущий в анаэробных условиях, что позволяет отнести его к виду S.cochnii (cochnii).

Используемый метод видовой дифференциальной диагностики стафилококков, указанный в заявке проверен на штаммах Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 25293, S.epidermidis ATCC 29457, других контрольных штаммах НИИ им. Тарасовича и более чем на 2000 культурах стафилококков, выделенных из клинического материала от больных с гнойно-септической патологией. Выявленная общность фенотипических признаков у разных видов стафилококков позволяет их объединить в группы и подгруппы для дальнейшего использования минимального количества дифференцирующих признаков, с помощью которых и определяется видовая принадлежность стафилококков.

Предложенный способ видовой дифференциальной диагностики стафилококков информативен и позволяет идентифицировать 31 вид. Он достоверен, может быть отнесен к классическим методам исследования, так как проводится на стандартных питательных средах и по классическим методикам, не требует для производства дорогостоящего оборудования, удобен при постановке, несложен в методическом плане. Поэтому без значительных материальных затрат и в короткие сроки может быть внедрен в работу любой бактериологической лаборатории.

Реферат патента 2008 года СПОСОБ ВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СТАФИЛОКОККОВ

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и эпидемиологии. В способе дифференциации тестов по определению биологических свойств стафилококков, выделенных из клинического материала и из внешней среды, используют классические питательные среды и стандартный режим инкубации, определяют ведущие признаки: фактор хлопьеобразования, ферменты плазмокоагулазы и уреазы, чувствительность к новобиоцину. Это позволяет сформировать стафилококки в группы, в каждой из которых используют комбинации признаков, выбранных из группы: определение гемолитической активности, размера колоний, β-галактозидазы, пигментообразования, роста культуры в режиме инкубации при температуре 45°С в анаэробных условиях, способность к разложению сахарозы, галактозы, маннита, маннозы, ксилозы и арабинозы, и по этим признакам определяют видовую принадлежность возбудителя. Изобретение обеспечивает повышение степени достоверности видовой дифференциальной диагностики стафилококков и сокращение сроков определения. 8 табл., 1 ил.

Формула изобретения RU 2 331 073 C2

Способ видовой дифференциальной диагностики стафилококков, выделенных от больных с гнойно-септической патологией и из внешней среды, путем определения их принадлежности по биологическим признакам к семейству и роду с использованием стандартных питательных сред и режима инкубации, отличающийся тем, что после установления семейства и рода у стафилококков определяют способность к хлопьеобразованию, наличие ферментов плазмокоагулазы, уреазы и чувствительность к новобиоцину с последующим определением в группы, в каждой из которых используют комбинации признаков, выбранных из: определение гемолитической активности, размера колоний, наличия β-галактозидазы, пигментообразования, роста культуры в режиме инкубации при 45°С и в анаэробных условиях, а также способность к разложению до кислых продуктов сахарозы, галактозы, маннита, маннозы, ксилозы и арабинозы, и по этим признакам определяют видовую принадлежность возбудителя.

Читайте также:

Для определения наличия плазмокоагулазы производят посев

Похожие патенты RU2331073C2

Реферат патента 2008 года СПОСОБ ВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СТАФИЛОКОККОВ

Формула изобретения RU 2 331 073 C2