Биореакторы для культивирования микроорганизмов и растений

Обновлено: 07.07.2024

Аппараты для проведения ферментативных процессов называют ферментаторами, а для создания наиболее благоприятных условий жизнедеятельности микроорганизмов – биореакторами.

Оборудование, предназначенное для культивирования микроорганизмов – продуктов биологически активных веществ, называют растильными установками.

Вибрационные растильные установки основаны на динамическом методе выращивания культур грибов в непрерывно движущемся вибрационном слое. Сущность способа заключается в том, что стерильную питательную среду, смешанную с посевной культурой, в процессе выращивания подвергают вибрационным колебаниям с одновременным перемещением в непрерывном потоке. Под действием высокочастотных колебаний в пределах 10…17,5 Гц питательная среда, находящаяся на транспортируемом органе, приобретает специфические свойства: становится более подвижной, уменьшается коэффициент внутреннего трения и снижается сопротивление перемещению. Колебательные импульсы передаются слою транспортируемой среды и она переходит во взвешенное состояние.

Режим вибрационного транспортирования характеризуется непрерывным обновлением поверхностного слоя: часть пути среда совершает в контакте с поверхностью грузонесущего органа, затем отделяется от нее, а через некоторое время снова падает. В результате среда интенсивно перемешивается. Каждая частица среды находится в непрерывном движении в течение 36 ч, при этом интенсивно аэрируются отдельные мельчайшие частицы среды, что в тысячи раз увеличивает активную поверхность среды по сравнению со статическим кюветным способом выращивания.

Физиологическая теплота, выделяемая культурой в процессе активного роста, отводится водой, в результате чего расход кондиционированного воздуха сокращается с 20 000 до 500 м 3 на 1 т культуры.

Применение вибрации позволяет интенсифицировать процессы массо- и теплообмена и микробиологического синтеза, механизировать все технологические операции, повысить активность культуры и организовать высокоэффективный процесс.

Вибрационная установка может быть как горизонтальной, так и вертикальной.

Рис. 22.15. Установка растильная винтового типа непрерывного действия

Вибрационная установка винтового типа непрерывного действия производительностью 3,5 т/сут (рис. 22.15) состоит из рамы 1, бункера для отрубей 2, стерилизатора 5, вибростерилизатора 3 и четырех, последовательно соединенных, герметизированных вертикальных вибрационных конвейеров лоткового типа 7. Собственно растильной частью установки являются первые три конвейера, составляющие соответственно первую, вторую и третью зоны роста. Четвертый конвейер предназначен для сушки культуры. Каждый виброконвейер снабжен индивидуальным приводом 8 с дебалансовыми вибраторами, трубопроводами 9, 10 и 11 для подачи среды соответственно на второй, третий и четвертый конвейеры.

Стерильная засеянная питательная среда из вибростерилизатора 3 поступает в приемный лоток 6 первого виброконвейера и под влиянием виброимпульсов, сообщаемых желобу от вибропривода 4, перемещается снизу вверх. Из верхнего лотка первого виброконвейера среда по трубе поступает в нижний приемный лоток второго виброконвейера. Конструктивно второй виброконвейер отличается от первого только тем, что лотки его снабжены водяной рубашкой для отвода теплоты, выделяемой в период активного роста культуры. Для отвода продуктов жизнедеятельности микроорганизмов во второй виброконвейер подается кондиционированный воздух. Из верхнего лотка второго виброконвейера среда поступает по трубе в нижний приемный лоток третьего виброконвейера, устройство которого аналогично первому.

Скорость движения среды по лоткам виброконвейеров составляет 2…3 мм/с, а диаметр и число витков всех виброконвейеров рассчитаны так, чтобы среда находилась в непрерывном движении в течение всего процесса роста. Из верхнего лотка третьего виброконвейера выращенная культура гриба по трубе поступает в нижний приемный лоток четвертого конвейера на сушку. Устройство этого виброконвейера идентично второму, но в рубашку лотков подают воду температурой 70 °С и дополнительно подводится воздух температурой 70…80 °С. Выращенная и высушенная культура гриба выгружается, а воздух после бактериальной очистки удаляется.

Техническая характеристика вибрационной растильной

установки винтового типа

Производительность по готовой культуре, т/сут

(при продолжительности роста 36 ч)………………………………… 3,5

Угол подъема винтового лотка (по среднему диаметру)……… 5°40¢

Диаметр желоба, мм:

Частота колебаний, Гц……………………………………………………… от 5 до 26

Амплитуда колебаний, мм………………………………………………… 5

Угол направления колебаний……………………………………………. 87°1¢; 89°30¢

Установленная мощность электродвигателя, кВт………………… 28…40

Габаритные размеры, мм…………………………………………………… 5100´8000´7200

Стерильный кондиционированный воздух, необходимый для аэрации в количестве 500…1800 м 3 на 1 т культуры, подается кондиционером.

Ферментаторы с механическим перемешиванием барботажного типа широко применяются для стерильных процессов выращивания микроорганизмов – продуцентов биологически активных веществ. Ферментатор (рис. 22.16) такого типа представляет собой вертикальный аппарат цилиндрической формы, изготовленный из стали Х18Н10Т или биметалла с эллиптическими крышкой и днищем. Отношение высоты к диаметру равно 2,6:1. На крышке аппарата расположен привод перемешивающего устройства, состоящий из электродвигателя 1, редуктора 2, муфты 3, подшипника 4 и сальника 5. Здесь же установлены штуцеры для загрузки питательной среды и посевного материала 18, подачи и вывода воздуха 19, смотровые окна, люки для погружения моющей механической головки, предохранительный клапан.

Рис. 22.16. Ферментатор с механическим перемешиванием барботажного типа

Для выгрузки культуры в днище аппарата предусмотрен спускной штуцер 16. Внутри корпуса 7 проходит вал 6 с закрепленными на нем перемешивающими устройствами, состоящими из закрытых турбин 8. Барботер 13 соединен с трубой 11 для подвода воздуха и выполнен в виде разборного ромба из перфорированных труб. В верхней его части расположены в шахматном порядке 2000…3000 отверстий. Вал 6 и перемешивающие устройства 8, 12, 14 с муфтами 10 и 15 приводятся во вращение от мотор-редуктора 2.

Ферментатор оборудован рубашкой 17, состоящей из 6…8 ярусов-секций. Каждая секция состоит из 8 навитых опоясывающих каналов, выполненных из уголкового профиля. Площадь поверхности охлаждения рубашки 60 м 2 , внутренняя поверхность которой состоит из змеевиков 9 диаметром 600 мм и общей высотой 2,4 м.

Ферментатор рассчитан для работы под избыточным давлением 0,25 МПа и стерилизации при 130…140 °С, а также для работы под разрежением. В процессе выращивания микроорганизмов давление внутри ферментатора в пределах 50 кПа; расход стерильного воздуха до 1 м 3 /мин. Высота столба жидкости в аппарате 5…6 м при высоте аппарата более 8 м.

Для обеспечения стерильности процесса предусмотрены торцевые уплотнения вала перемешивающего устройства с паровой защитой. Торцевые уплотнения рассчитаны для работы при давлении до 0,28 МПа и остаточном давлении не ниже 2,7 кПа, температуре 30…250 °С и частоте вращения вала до 500 мин –1 . С помощью торцевых уплотнений удается практически полностью предотвратить утечку среды или попадание воздуха в полость аппарата в месте вывода вала.

Торцевые уплотнения, соприкасающиеся с рабочей средой, изготовляются из стали Х18Н10Т и Х17Н13М2Т, а также из титана ВТ-10. Длительность безотказной работы торцевого уплотнения не менее 2000 ч при ресурсе работы 8000 ч. Допустимое радиальное биение вала в зоне торцевого уплотнения не более 0,25 мм, угловое биение вала не более 0,25°.

Техническая характеристика ферментаторов с механическим

перемешиванием

Вместимость ферментатора, м 3 ………………………………. 25, 49, 63, 200

Рабочее давление, МПа…………………………………………. 0,2…0,3

Коэффициент заполнения………………………………………. 0,5

Скорость выхода воздуха из аэратора, м/с………………. 25

Удельный расход воздуха, м 3 на 1 м 3

растущей культуры микроорганизма……………………… 0,5…2,0

Цилиндрический эрлифтный ферментатор (вместимостью 1300 м 3 ) предназначен для непрерывного выращивания дрожжей на сусле, которое является отходом гидролизно-дрожжевого производства.

Он представляет собой стальной сварной корпус 1 с днищем в виде усеченного конуса и конической крышкой с центральным отверстием (рис. 22.17). Внутри аппарата установлены четыре диффузора 7, которые создают четыре самостоятельно циркулирующих потока. Через коллектор 2 в центральные трубы каждого диффузора, на конце которых имеются конус и кювета 8, подается сжатый воздух.

На крышке аппарата установлен распределительный бачок, куда через штуцера 3, 4 и 5 поступают бражка, сусло, засевные дрожжи и аммиачная вода. Все компоненты смешиваются и образуют питательную смесь, которая свободным потоком по трубам диаметром 100 мм поступает вниз, в кюветы аэрирующего устройства.

Питательная смесь, переливаясь через край кюветы, смешивается с воздухом, выходящим через щели под кюветой. Образовавшаяся воздушно-жидкостная эмульсия поднимается вверх по диффузору к отбойнику 6, откуда, разрушаясь, стекает вниз. Для наружного охлаждения стенок аппарата установлен ороситель в виде коллектора.

Биореактор (ферментатор) представляют собой аппарат для культивирования микроорганизмов, растительных и животных клеток, в котором происходят биохимические реакции.

Системы биореакторов изготавливаются из стекла (лабораторные) и нержавеющей стали (пилотные и промышленные). Биореакторы можно подразделить на биореакторы для культивирования грибов и бактерий, клеток и тканей растений, а также клеток и тканей животных.

Устройство биореакторов - это герметичные цилиндрические емкости, объемом 0,05-200 м3. Размеры ферментаторов определяются соотношением внешнего диаметра к высоте, которое варьирует обычно в пределах от 1:2 до 1:6.

В биореакторе устанавливают мешалки турбинного, пропеллерного или иного типа.

Для поддержания температуры в системе биореактора является двойной кожух или теплообменник по типу змеевика.

Кроме этого, устройство биореактора имеет трубопроводы для подвода питательной среды, воды, пара, воздуха, пеногасителей и других веществ.

Для контроля и регулирования процессов биосинтеза устройства биоректоров оборудованы измерительными и регулирующими устройствами: измерение температуры, рН, обороты мешалки, уровня пены, концентрации биомассы и др.

Система биореактора используют для проведения аэробных и анаэробных процессов ферментации. Во время аэрации и перемешивания питательной среды в процессе ферментации образуется пена, которая может нарушить стерильность процесса и вызвать потерю культуральной жидкости. В связи с этим рабочий объем внутренней системы биореактора не должен превышать 7/10 общего объема. Для пеногашения используют как химические вещества, так и механические методы.

Различают установки для глубинного и поверхностного культивирования. Для поверхностного культивирования микроорганизмов на твердых питательных средах используют установки биореакторов различных конструкций.

Аппараты периодического действия обычно имеют вид горизонтальных барабанов, а аппараты непрерывного действия - колонн, разделенных на определенное количество секций в зависимости от мощности производства и технологии культивирования.

Биореакторные установки для глубинного культивирования, в свою очередь, подразделяют на 3 группы:

с подводом энергии в газовой фазе;
в жидкой фазе;
в жидкой и газовой фазе.

Устройство биореакторов указанных групп имеют большое количество общих элементов. Разница заключается в конструкциях перемешивающих устройств и таких, по которым осуществляется аэрация. К ферментаторам 1-й группе относятся барботажные, барботажно-эрлифтные, колонные и др.

Среди аппаратов 2-й группы можно выделить три основные группы: ферментаторы с Самовсасывающие мешалками, струйные и эжекционного. В Б. 3-й группы энергия подводится к жидкой фазы с помощью перемешивающих устройства, а к газовой фазы - путем принудительной подачи воздуха.

К. Шюгерль (1982) предложил подразделять устройства биореакторов на 3 основные группы по способу потребления энергии для диспергирования и перемешивания стерильного воздуха:

энергия используется на механическое движение внутренних элементов;
энергия используется на работу внешнего насоса, который обеспечивает рециркуляцию жидкости и / или газа;
энергия используется на подачу и сжатие газа в культуральную жидкость.

Полезно знать

© VetConsult+, 2015. Все права защищены. Использование любых материалов, размещённых на сайте, разрешается при условии ссылки на ресурс. При копировании либо частичном использовании материалов со страниц сайта обязательно размещать прямую открытую для поисковых систем гиперссылку, расположенную в подзаголовке или в первом абзаце статьи.

Биореактор , который часто называют как ферментер , представляет собой контейнер , в котором некоторые микроорганизмы , клетки или небольшие растения , которые выращивают (также: ферментированный ) в наилучших возможных условиях . Таким образом, работа биореактора - это применение биотехнологии, которое использует биологические процессы ( биоконверсию , биокатализ ) в технических средствах или делает их пригодными для использования.

Важными факторами, которые можно контролировать или отслеживать в большинстве биореакторов, являются состав питательной среды (также питательный раствор или субстрат ), подача кислорода , температура, значение pH , стерильность и другие. Целью культивирования в биореакторе может быть получение клеток или компонентов клеток или получение продуктов метаболизма . Они могут, например, B. использоваться в качестве активного ингредиента в фармацевтике или в качестве основного химического вещества в химической промышленности . Разложение химических соединений также может происходить в биореакторах, таких как Б. при очистке сточных вод на очистных сооружениях . Производство пива, вина и других продуктов, которые производятся на протяжении тысячелетий, также происходит в биореакторах. В отличие от современных приложений, эти классические примеры обычно называют не биореакторами, а исторически сложившимися терминами (например, пивоваренный котел в производстве пива).

В биореакторах для различных целей выращивают самые разные организмы. Поэтому доступно несколько вариантов реакторов в различных исполнениях. Типичными являются реакторы с мешалкой из металла, которые могут иметь объем от нескольких до тысяч литров и заполнены питательным раствором. Но и сильно различающиеся варианты, такие как. Б. Используются реакторы с неподвижным слоем , фотобиореакторы .

история

Поскольку пивоваренные котлы на пивоварнях технически являются частью биореакторов, появление первых биореакторов можно приравнять к появлению первых пивоварен около 5500 лет назад. Устройства для производства различных молочных продуктов с помощью бактерий или ферментов, которые используются в течение тысяч лет, также можно назвать биореакторами.

С дальнейшим развитием биотехнологии , особенно благодаря значительным достижениям в микробиологии в 19 веке и в генетике , молекулярной биологии и генной инженерии с середины 20 века, появляется все больше и больше приложений, таких как химическая промышленность и фармацевтический сектор , может быть развит. Биореакторы используются во многих биотехнологических процессах .

Рабочие параметры

Основная цель биореактора - обеспечить максимально возможный выход продукта. Это достигается, в частности, за счет создания оптимальных условий для используемого организма в каждом конкретном случае. Он адаптирован к различным параметрам, преобладающим в его естественной среде обитания. Важны тип и концентрация питательных веществ , температура, содержание кислорода, значение pH и т. Д. Кроме того, обычно требуется мешалка или другое устройство , чтобы гарантировать, что эти параметры установлены однородно по всему пространству реактора. Помимо требований организмов, необходимо также учитывать другие технические, организационные и экономические факторы, влияющие на выбор рабочих параметров. Примерами являются предотвращение образования пены и выбор непрерывного или периодического режима работы .

С помощью зондов или датчиков многие из этих параметров измеряются непосредственно в питательной среде или в отработанном воздухе. Ход процесса обычно можно оценить с помощью этих параметров. Плотность клеток можно определить путем измерения экстинкции (оптической плотности) , которая, в свою очередь, указывает количество продукта. Альтернативой часто является измерение концентрации характерного химического соединения, например Б. увеличение концентрации продукта метаболизма или уменьшение концентрации субстрата.

В начале ферментации питательная среда смешивается с небольшим количеством микроорганизмов, полученных в результате предварительного культивирования . Это количество называется инокулятом , а процесс часто называют инокуляцией . Суспензия ( бульон ), полученная в процессе ферментации, обрабатывается так называемой последующей обработкой в несколько этапов процесса.

Подача питательных веществ

Благодаря питательной среде у организмов есть все необходимые для роста питательные вещества . К ним относятся основные питательные элементы (макроэлементы), необходимые в больших количествах , такие как Б. углерод , азот и фосфор . Также необходимы различные микроэлементы (микроэлементы). В зависимости от организма необходимы другие соединения, которые невозможно синтезировать самостоятельно ( витамины , незаменимые аминокислоты и т. Д.). Подключение к источнику питания, такое как Б. часто необходима сахарная глюкоза (кроме фототрофных организмов).

температура

У организмов есть оптимальная температура, при которой они лучше всего размножаются. Превышение этой температуры может привести к необратимому повреждению из-за денатурации белков, а падение ниже этой температуры приводит к снижению скорости метаболизма и, следовательно, к увеличению времени процесса. Температура управления осуществляется путем нагрева и охлаждения контуров. Когда реактор запускается, все содержимое реактора нагревается или нагревается до рабочей температуры. В некоторых случаях культивируемые организмы выделяют столько отработанного тепла за счет своего метаболизма, что при определенной концентрации клеток активен только контур охлаждения. В эту схему может быть встроен теплообменник или же энергоноситель подается напрямую. В большинстве случаев только двойная стенка контейнера и, в редких случаях, встроенные охлаждающие регистры доступны в качестве поверхностей теплообмена с реакционным пространством.

Содержание кислорода

Подходы к ферментации могут, в зависимости от организма и продукта, проводиться аэробно (в кислородсодержащей атмосфере) или анаэробно (без кислорода). Кислород плохо растворяется в воде, поэтому достаточное количество аэробных подходов затруднено. Растворимость кислорода в ферментационной среде с температурой 37 ° C составляет, например, 3-5 мг / л. Парциальное давление кислорода можно регулировать различными способами:

Изменение расхода газа,
Изменение скорости мешалки,
Изменение геометрии перемешивающего инструмента,
Изменение состава газовой смеси,
Изменение напора (это также увеличивает растворимость других газов, например диоксида углерода).

Однако, если вдувается слишком много газа или скорость мешалки слишком высока, нежелательное пенообразование также увеличивается.

Однако в случае обязательных анаэробных организмов следует избегать подачи кислорода, так как он может быть токсичным. В случае анаэробных подходов с факультативными анаэробными организмами подача кислорода может вызвать нежелательные аэробные реакции, которые могут снизить выход процесса.

Значение PH

Культурные организмы обычно имеют ограниченный диапазон толерантности к pH с оптимумом pH. Значение pH можно контролировать с помощью насосов, автоматически подключенных к датчику pH, который можно использовать для подкисления, например, фосфорной кислоты (H ₃ PO ₄ ), соляной кислоты (HCl) или для увеличения значения pH, например, гидроксида натрия. (NaOH). Закачать в биореактор. В некоторых случаях pH также может быть достигнут за счет скорости подачи субстрата.

Гомогенизация

Большинство биореакторов имеют перемешивающее устройство, например. Б. мешалка или газовый инжектор, через который циркулирует среда. Это обеспечивает однородную настройку различных параметров во всем реакторе и, следовательно, более однородный технологический поток.

Вспенивание

Образование пены из-за перемешивания часто бывает проблематичным , что может засорить фильтр вытяжного воздуха и вызвать механическую нагрузку на культивируемые клетки. Химические пеногасители (пеногасители) снижают поверхностное натяжение . Отрицательные побочные эффекты - это влияние на транспортировку газа и плохая отделяемость от реакционного раствора во время последующей обработки (подготовка продукта).

Механические пеногасители, такие как пеногасители, разрушают пену, но не удаляют пенообразующие факторы, такие как, например, Б. мертвые клетки. С помощью сепараторов пены пена отводится и снова сжижается, а затем ее можно откачать.

Непрерывный или пакетный режим работы

Различают режимы работы ферментера:

Периодический режим: заполнение реактора, отсутствие добавления и удаления в процессе ферментации, простой контроль, маловероятное загрязнение
Fed-batch операция: аналогична пакетной операции; однако z. B. Добавление субстрата во время процесса, так как изначально высокая концентрация субстрата может препятствовать
Непрерывная работа в биореакторе Chemostat : непрерывная работа за счет добавления субстрата и удаления продукта, сложный контроль, загрязнение проблематичны, но дорогостоящие и трудоемкие последующие процессы также могут выполняться непрерывно и, таким образом, оптимально использоваться

В исследованиях более вероятно, что будет проводиться периодическая ферментация, в то время как на более крупных производственных предприятиях налаживание непрерывной работы может иметь экономический смысл.

Реакторы

Типы реакторов

Рабочие параметры, которые необходимо соблюдать для используемых организмов, или по техническим, организационным и другим причинам, сильно различаются. Следовательно, соответствующий биореактор должен быть спроектирован для соответствующего использования, или может быть использован тип реактора, в котором можно регулировать различные параметры в широком диапазоне, чтобы его можно было использовать для различных целей. Распространенным типом является резервуарный реактор с газовой мешалкой в различных версиях (материал, размер и т. Д.).

Дифференциация по технологии перемешивания

В каждом биореакторе есть три фазы: твердая ( биомасса ), жидкая (питательная среда) и газообразная (например, воздух , кислород, углекислый газ , азот ). В биореакторе их распределение поддерживается однородным с помощью различных мер:

Подвижные механические приспособления (мешалки): например, Б. в реакторе с мешалкой
внешний контур насоса: жидкость циркулирует с помощью насоса, например Б. Свободно-струйный реактор
Вдувание газа: газовая фаза вдувается в жидкую часть, например. Б. Эрлифтный реактор или реактор сбарботажной колонной

Если эти формы реакторов снабжены направляющими трубками , получаются следующие типы реакторов:

Пропеллерный петлевой реактор (реактор, в который энергия вводится с помощью мешалки, перемещающейся в осевом направлении вниз и снабженной направляющей трубкой)
Струйный петлевой реактор (свободноструйный реактор с направляющей трубкой)
Петлевой реактор Mammoth (эрлифтный реактор или реактор с барботажной колонной с вытяжной трубой)

Дифференциация по структуре

Дальнейшее различие возможно по типу конструкции реактора:

Реактор с мешалкой : обычный; жидкая фаза циркулирует с помощью мешалки; при необходимости проводится фумигация
Реактор с неподвижным слоем : реактор заполнен твердой пористой матрицей, на которой можно иммобилизовать организмы (или ферменты); организмы остаются в реакторе вместо того, чтобы вымываться средой, так что рост организмов является менее ограничивающим фактором (или уменьшается потребность в ферментах)
Капельный реактор (капельный фильтр): неподвижный слой опрыскивают жидкостью (например, очищаемыми сточными водами); разлагающие организмы сидят на поверхности; Воздуха (кислород) , необходимая для разложения вводятся в противотоке
Фотобиореактор ( водорослевой реактор , водородный биореактор ): для выращивания фотосинтезирующих организмов (водоросли, растения (клетки)); реактор сделан из стекла, чтобы до организмов попадал необходимый свет; Использование света оптимизируется с помощью пластинчатых или трубчатых реакторов (см. Ниже: трубчатый реактор).
Трубчатый реактор : в трубчатых реакторах может возникать поршневой поток , который z. B. используется в некоторых ферментерах биогазовых установок ; уже разложившийся и свежий материал ( субстрат ) не полностью перемешан, что может иметь различные преимущества
Мембранный биореактор : реактор, в котором (в зависимости от применения) продукт реакции, биомасса или очищенная вода могут быть постоянно разделены через мембраны . Применения для этого - очистка сточных вод (MBR), извлечение молочной кислоты и фармацевтические продукты.

В исследованиях в качестве лабораторных ферментеров используются небольшие реакторы с мешалкой или часто колбы Эрленмейера , которые присоединяются к так называемому шейкеру для перемешивания среды.

В прошлом твердые биореакторы преобладали в некоторых областях из-за более простого управления технологическим процессом . Жидкое культивирование, также известное как погруженная ферментация , было трудно контролировать, но сегодня оно преобладает из-за различных преимуществ, таких как лучшие варианты подачи кислорода посредством перемешивания и аэрации.

Многоразовые и одноразовые реакторы

Большинство биореакторов изготовлено из металла ( нержавеющая сталь ) или стекла. Это позволяет легко чистить и стерилизовать и, следовательно, многократно использовать.

С другой стороны, в технологии культивирования клеток животных все чаще используются одноразовые биореакторы в виде предварительно стерилизованных одноразовых пакетов. Они состоят из композитной пленки . Одноразовые пакеты позволяют избежать дорогостоящих процессов очистки и стерилизации, что, в частности, при производстве биологических препаратов приводит к значительному сокращению времени на установку и, таким образом, к экономии средств. Большинство одноразовых биореакторов не являются реакторами с мешалкой. Вместо этого циркуляцию берет на себя качающееся устройство.

Основная ферментация
Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и нагретую до требуемой температуры среду посевного материала и до завершения процесса роста клеток или биосинтеза целевого продукта [49]. По окончании ферментации образуется сложная смесь, состоящая из клеток продуцента, раствора непотребленных питательных компонентов и накопившихся в среде продуктов биосинтеза. Такую смесь называют культуральной жидкостью.

Технологические особенности процессов ферментации
По технологическому оформлению различают следующие микробиологические процессы: аэробное и анаэробное культивирование; твердофазное, поверхностное и глубинное культивирование; периодическое и непрерывное культивирование.
Аэробное культивирование — аэрация среды — непременное условие в тех микробиологических процессах, в которых используются аэробные микроорганизмы-продуценты.
Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кислороде зависит от окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов. Для биосинтеза 1 кг дрожжевой биомассы необходимо, например, 0,74–2,6 кг молекулярного кислорода. При интенсивном потреблении субстрата независимо от источника углерода продуцент ассимилирует 0,83–4,0 мг кислорода/1 л среды/мин.
Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов (табл. 1). При давлении 0,1 МПа и температуре 30°С в 1 л дистиллированной воды максимальное количество растворенного кислорода составляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода колеблется в интервале 2–5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5–2 мин.
При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость абсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсивности перемешивания среды (табл. 2).
Во время роста биомассы микроорганизмы обычно потребляют больше кислорода, чем во время сверхсинтеза целевого метаболита. Принято говорить о критической концентрации кислорода, при которой наблюдается лимитация дыхания клеток. Для большинства аэробных микроорганизмов, растущих в сахаросодержащих субстратах, критическая концентрация кислорода 0,05–0,10 мг/л, что соответствует 3–8 % от полного насыщения среды кислородом. Лимитация роста и физиологической деятельности клеток наблюдается при более высоких концентрациях кислорода: на средах с глюкозой рост дрожжей лимитируется при рО2 на уровне 20–25 % от полного насыщения.
Оптимальной для роста биомассы считается концентрация кислорода 50–60 % от полного насыщения, для биосинтеза целевых метаболитов — 10–20 %.

Таблица 1.
Зависимость абсорбции кислорода в воде (мг/л) от концентрации диспергированных компонентов (20 °С)

Сахароза		Подсолнечное масло		Биомасса
концентрация, %	абсорбция О₂	концентрация, %	абсорбция О₂	концентрация, %	абсорбция О₂
0	8,2	0	8,9	0	8,0
2,5	7,8	0,05	11,6	3,0	4,1
5,0	7,2	0,10	18,9	6,0	2,4
7,5	6,6	0,15	19,0	9,6	1,5
10,0	5,9	0,20	22,3	16,0	1,2
15,0	4,8	0,25	24,0	32,0	0,8

Таблица 2.
Зависимость скорости абсорбции кислорода в воде от аэрации и перемешивания среды* (мг/(л • мин))

Количество подаваемого воздуха, м 3 /(м 3 *мин)	Частота вращения мешалки, мин -1
Количество подаваемого воздуха, м 3 /(м 3 *мин)	0	500	800	1000	2000
0,35	1,3	4,0	7,5	14,5	15,1
0,65	3,5	7,3	12,1	19,1	22,1
1,00	6,0	10,0	15,0	23,0	24,0
1,30	7,5	13,9	18,0	26,0	28,0
1,60	11,0	15,5	20,0	27,0	29,0

Если субстрат сыпучий, то отдельные твердые частицы его хорошо контактируют с воздухом, рост микроорганизмов в этом случае происходит главным образом на поверхности твердых частиц, а также в порах, заполненных либо водой, либо воздухом. Обеспечение микроорганизмов кислородом затрудняется с увеличением слоя субстрата. Перемешивание слоя не допускается, если культивируются мицелиальные микроорганизмы, например микромицеты, и из-за отсутствия перемешивания рост микроорганизмов происходит по принципу колонизации, поэтому часто возникает локальная нехватка питательных веществ. Другая проблема при твердофазной ферментации — отвод теплоты и поддержание постоянной температуры во всей ферментационной среде.
Однако твердофазные процессы имеют и преимущества по сравнению с процессами, протекающими в жидкой среде:
• они требуют меньших затрат на Лабораторное оборудование и эксплуатацию;
• характер субстрата облегчает отделение и очистку продукта;
• низкое содержание воды в субстрате препятствует заражению культуры продуцента посторонней микрофлорой;
• твердофазные процессы не связаны со сбросом в окружающую среду большого количества сточных вод.

Управляемый процесс твердофазной ферментации в промышленных условиях осуществлен при производстве ферментов с использованием микромицетов. Сыпучий субстрат с культурой инкубируют в тонком слое (3–7 см) в кюветах, размещенных в камерах, где поддерживают оптимальные температуру и влажность воздуха, обеспечивают принудительную циркуляцию газовой фазы вдоль поверхности ферментируемого субстрата. Воздух в данном случае является и аэрирующим, и теплоотводящим агентом.
Более толстый слой гранулированного крахмалсодержащего субстрата используют для протеинизации (до 20 %) корма при помощи Asp. niger. В данном случае применяют неинтенсивное перемешивание среды.
Поверхностная ферментация на жидких субстратах реализуется в кюветах со средой, помещенных в вентилированные воздухом камеры. Культура микроорганизмов при этом образует биомассу в виде пленки или твердого слоя на поверхности жидкой среды. Культура потребляет кислород непосредственно из газовой фазы — воздуха. Массообмен в таких условиях малоинтенсивный.
Глубинное культивирование микроорганизмов происходит во всем объеме жидкой питательной среды, содержащей растворенный субстрат. Ферментер должен обеспечивать рост и развитие популяций микроорганизмов в объеме жидкой фазы, подвод питательных веществ к клеткам микроорганизмов, отвод от микробных клеток продуктов их обмена веществ (метаболизма), отвод из среды выделяемого клетками тепла.
Глубинное культивирование можно осуществлять периодическим и непрерывным способами.
Периодическое культивирование. При периодическом способе культивировании в ферментер загружают сразу весь объем питательной среды и вносят посевной материал. Выращивание микроорганизмов проводят в оптимальных условиях в течение определенного времени, после чего процесс останавливают, сливают содержимое ферментера и выделяют целевой продукт.
Этап роста культуры включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, фазу замедления роста, стационарную фазу, фазу отмирания.
Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой. Существует также объемно-доливочное культивирование, когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалентного объема среды (полунепрерывное культивирование).
Непрерывные процессы. При непрерывном способе питательная среда непрерывно подается в ферментер (биореактор), в котором создают оптимальные условия для роста микроорганизмов, а из ферментера (биореактора) также непрерывно вытекает культуральная жидкость вместе с микроорганизмами.
В непрерывных процессах биообъект поддерживается в экспоненциальной фазе роста. При этом существует равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой.
Из непрерывных процессов лучше всего изучен метод глубинной ферментации. Процесс может быть гомогенно или гетерогенно-непрерывным.
При гомогенно-непрерывном процессе в аппарате, где идет интенсивное перемешивание, все параметры постоянны во времени.
При гетерогенно-непрерывном процессе несколько ферментеров соединены вместе. Питательная среда поступает в первый аппарат, готовая культуральная жидкость вытекает из последнего.
При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо предотвратить вымывание культуры из системы, т. е. обеспечить постоянную концентрацию клеток. В стерильных условиях непрерывный, проточный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.
В зависимости от метода, благодаря которому культура поддерживается в состоянии динамического равновесия (когда ? = D), различают турбидостатный и хемостатный принципы.
При турбидостате скорость притока среды такова, что концентрация биомассы в системе постоянна; при хемостате в системе ограничивают рост культуры одним элементом питания (углерода, кислорода, соответствующего витамина и др.) при нелимитируемых количествах остальных. Известны также методы управления ростом проточной культуры по рН (рН-стат), по кислороду (оксистат).
В зависимости от цели производства — получение клеток или продуктов их жизнедеятельности — способы ведения основной ферментации различаются. Если процесс направлен на получение биомассы, то назначение ферментации — получить максимально возможный титр клеток, а в случае получения метаболитов их накопление осуществляют одновременно, причем максимумы образования продуцента и целевого продукта всегда сдвинуты по времени. Поэтому продолжительность ферментации в первом случае всегда меньше, чем во втором.
Если целью является получение биомассы промышленного штамма в периодическом процессе, то время культивирования не превышает 24 ч. При производстве первичных метаболитов время биосинтеза составляет 48–72 ч, а вторичных — 72–144 ч.
При культивировании различных микроорганизмов интервал рабочих температур варьирует в пределах 25–60°С, значения рН — 2?9, расход воздуха в аэробных процессах — 0,15–2,5 м3/1 м3 среды/мин.

Конструкции ферментеров (биореакторов)
В микробиологических производствах в зависимости от особенностей процесса применяют разнообразные ферментеры, или биореакторы.
Аппараты для аэробной поверхностной ферментации широко применяются для производства органических кислот. Поверхностная жидкофазная ферментация протекает в так называемых бродильных вентилируемых камерах, в которых на стеллажах размещены плоские металлические кюветы. В кюветы наливают жидкую питательную среду (высота слоя составляет 80–150 мм), затем с потоком подаваемого воздуха среду инокулируют спорами продуцента. В камере стабилизируется влажность, температура и скорость подачи воздуха. После завершения процесса культуральная жидкость сливается из кювет через вмонтированные в днище штуцеры и поступает на обработку.
При твердофазной ферментации процесс также протекает в вентилируемых камерах, но вместо кювет на стеллажах размещают лотки, в которые насыпают сыпучую твердую среду слоем 10–15 мм. Для лучшей аэрации среды подаваемый в камеру воздух проходит через перфорированное днище лотков.
Аппараты для аэробной глубинной ферментации наиболее сложны как конструкционно, так и с точки зрения их эксплуатации. Главная задача — обеспечение высокой интенсивности массо и энергообмена клеток со средой.
По структуре потоков ферментеры (биореакторы) могут быть аппаратами полного перемешивания или полного вытеснения.
Конструктивные различия ферментеров (биореакторов) определяются в основном способами подвода энергии и аэрации среды:
• ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к газовой фазе;
• ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к жидкой фазе;
• ферментеры (биореакторы) с комбинированным подводом энергии.

Ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к газовой фазе. В аппаратах этого типа аэрация и перемешивание культуральной жидкости осуществляются сжатым воздухом, который подается в ферментер (биореактор) под определенным давлением. К таким ферментерам (биореакторам) относят:
• барботажные ферментеры (биореакторы), подача воздуха в которых осуществляется через барботажные устройства, расположенные в нижней части аппарата;
• аппараты с диффузором (эрлифтные аэраторы), имеющие внутренний цилиндр-диффузор, который обеспечивает перемешивание поступающих по распределительным трубам в нижнюю часть аппарата субстрата и воздуха;
• трубчатые ферментеры (биореакторы) (газлифтные), состоящие из реактора кожухотрубчатого типа, через который жидкость потоком воздуха перемещается в верхнюю часть аппарата и, попадая в сепаратор, возвращается в реактор, где снова увлекается воздухом, подвергаясь таким образом циркуляции;
• ферментеры (биореакторы) с форсуночным воздухораспределением, оборудованные форсунками для подачи воздуха, расположенными в нижней части аппарата, и находящимся над ними диффузором, который обеспечивает внутреннюю циркуляцию жидкости;
• ферментеры (биореакторы) колонного типа, представляющие собой цилиндрическую колонну, разделенную горизонтальными перегородками (тарелками) на секции; воздух барботирует через слой жидкости каждой тарелки, а перемещение жидкости через кольцевую щель обеспечивает противоточное движение жидкой и газовой фаз.

Ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к жидкой фазе. К таким аппаратам относят:
• аппарат с самовсасывающей турбиной, имеющий цилиндрический диффузор и мешалку с полыми лопастями и валом, при вращении которой за счет создаваемого разрежения происходит самовсасывание воздуха, благодаря чему происходит подъем жидкости в кольцевом зазоре между диффузором и стенками аппарата с последующим ее возвращением в диффузор;
• ферментер (биореактор) с турбоэжекторными перемешивающими устройствами — аппарат, разделенный вертикальными перегородками на секции, в каждой из которой имеется самовсасывающая мешалка турбинного типа (эжектор) и диффузор; для перемещения жидкости из секции в секцию в перегородках сделаны окна.

где KLa — объемный коэффициент массопередачи на границе газ—жидкость; Сp — равновесная концентрация кислорода в среде; С — фактическая мгновенная концентрация кислорода в среде.
Основные факторы среды, определяющие рост и биосинтетическую активность продуцентов

Читайте также: